【正文】 n 1 After Column Wash with 100% CAN經(jīng)100%乙腈沖洗后 峰3 峰形極好 Peaks 裂峰Injection Solvent Effects 溶劑化效應Column: StableBond SBC8, 250mm, 5181。 of Column Problems 色譜柱問題的類型 A. Pressure 壓力 B. Peak shape 峰形 C. Retention 保留時間 Issues壓力問題 Column Observations Potential Problems色譜柱觀測 潛在的問題 High pressure Plugged frit 壓力高 堵塞濾頭 Column contamination 色譜柱污染 Piugged packing 堵塞填料 the Cause and Correcting High Back Pressure 查出原因 糾正壓力Check pressure with/without column many pressure problems are due to blockages in the system or guard有／無柱子時檢查壓力 － 許多壓力問題是由于系統(tǒng)或保護柱的阻塞If Column Pressure is high 如果柱壓高:Wash column Eliminate column contamination and 沖洗柱子 plugged packing 排除柱污染和填料堵塞 high molecular weight/adsorbed pounds 高分子量／被吸附化合物 precipitate from sample or buffer 樣品或緩沖液中的沉淀物Back flush column Clear plugged frit 反沖柱子－清潔阻塞的濾頭Change frit Clear plugged frit 更換濾頭 Cleaning 柱子清洗Flush with stronger solvents than your mobile phase用比你的流動相更強的溶劑沖洗 ReversedPhase Solvent Choices in Order of Increasing Strength 為了增加強度選擇反相溶劑Use at least 25 ml of each solvent for analytical columns 對于分析柱每種溶劑至少用25 ml 沖洗Mobile phase without buffer salts 沒有緩沖鹽的流動相100% Methanol 甲醇100% Acetonitrile 乙腈75% Acetonitrile :25% Isopropanol 75乙腈 ： 25％異丙醇100% Isopropanol 異丙醇l100% Methylene Chloride★ 二氯甲烷l100% Hexane ★ 已烷★ When using either Hexane or Methylene Chloride the column must be flushed with lIsopropanol before returning to your resveredphase mobile phase.當用已烷蔌二氯甲烷柱子時,必須先用異丙醇沖洗,然后再用你的反相流動相 Cleaning柱子清洗Normal Phase Solvent Choices in Order of Increasing Strength為了增加強度選用正相溶劑Use at least 50 ml of each solvent 每種溶劑至少用50 ml50% Methanol : 50% Chloroform 50% 甲醇 : 50% 氯仿100% Ethyl Acetate 乙酸乙酯 to Change a Frit 怎樣更換濾頭Column Inlet Frit 柱進口濾頭Column Body 柱身Compression Ferrule 壓縮金屬套圈Wear gloves 戴手套Do not allow bed to dry 不要讓底座干燥Do not touch the columnbody heat will extrude packing 不要使柱身受熱,否則填料會噴出Do not over tighten 不要旋得太緊Female End Fitting 旋好尾端螺母Male End Fitting 旋好尾端螺頭 Back Pressure Problems壓力問題的預防Use column protection 柱保護 Guard columns 保護柱/預柱 Inline filters 在線過濾器 Sample Preparation 樣品預處理Appropriate column flushing 適當?shù)闹鶝_洗Filter buffered mobile phase 過濾緩沖流動相 Back Pressure Problems:InLine Devices 壓力問題的預防:在線裝置Mobile Phase PreColumn Injector Filter GuardFrom Pump 預柱 進樣器 濾頭 Column從泵來的流動相 保護柱 Analytical ColumnFilter and Guard Column Act on Sample 分析柱 濾頭和保護柱作用于樣品 PreColumn Acts on Mobile Phase 預柱作用于流動相 To Detector 到檢測器Preventing Back Pressure Problems: Sample Preparation:樣品制備Solvent/Chemical Environment 溶劑/化學環(huán)境Particulate/Aggregate Remove 微粒/凝聚物的除去Filter samples 過濾樣品Centrifugation 離心分離Solid Phase Extraction(.) 固相萃取Cartridges or Plates 薄膜或薄層板Disks or Membranes 圓盤或生物膜Peak Shape Issues Split peaks 裂峰Peak tailing 峰拖尾Broad peaks 寬峰Poor efficiency 低柱效Many peak shape issues also . Broad and tailing or tailing with increased retention許多峰形問題是結合在一起的例如:展寬和拖尾或拖尾和保留時間增加 Peaks 裂峰Can be caused by: 可能的原因:Column contamination 柱污染Partially plugged frit 部分阻塞濾片Column void 柱頭塌陷Injection solvent effects 溶劑效應 Peaks 裂峰Column Contamination 柱污染Column: StableBond SBC8, 250mm, 5181。Systemand色譜柱和色譜系統(tǒng)的故障檢修HPLC出于各種目的，也會出現(xiàn)有人故意設置故障。必要時儀器或工程師要承擔責任，背“黑鍋”。更不能*不停地換板子和部件來縮小故障源，否則招一民工教教即會（目前此類維修者最多，既可收費又簡單）。從此就再也沒這么麻煩了。原來儀器有屏幕保護功能，該科室無專人保管使用，使用者用好就走，后一使用者一看屏幕暗的，就開開關。如筆者碰到一臺血球計數(shù)儀，前任幾個工程師無數(shù)次維修，持續(xù)二年，還換過新機器，但不到半年又重復出現(xiàn)故障，麻煩不斷。（重要步驟）5. 了解用戶的操作習慣、操作人員結構和水平，科室經(jīng)濟情況等也會對維修有很大幫助。應先檢查電源是否穩(wěn)定、負載是否過重、地線是否良好、電極等附件是否良好和正常、各接口是否正確等。如是否關機時間長了？晝夜溫差是否很大？儀器放置的位置是否離電梯間很近? 儀器附近還有什么儀器在使用？計算機設置是否正確？等等。 指望打開機殼看哪里有斷線或明顯故障之處，純粹是在碰運氣，即使好運也不可能每次都這樣。2. 先外部，后內(nèi)部。仔細觀察，不輕信用戶的口述，尤其是第三者的轉述。對于選擇保護柱的原則是：在滿足分離分析要求的前提條件下，盡可能的選擇較短的保護柱，盡可能選擇對分離樣品小一些保留性的填料。大多數(shù)人是根據(jù)色譜分析柱的填料來選擇保護柱的填料，正常情況下可以選擇與分析色譜柱一樣的色譜填料。手緊式保護柱從結構上講是與直連式保護柱一樣，只是在連接時不用借助扳手等工具，直接用手上緊即可。整體式設計是由色譜柱的生產(chǎn)廠商直接安裝在色譜分析柱上的，必須與色譜分析柱一同訂貨，可以非常方便的使用，但不能被修改。另外，薄膜裝填法的保護柱所裝填的色譜填料有限，只能提供很有限的保護作用；不過也因為所裝填的色譜填料較少，保護柱的長度也較短，所以對分析樣品的保留時間的影響也很小。保護柱的填料裝填方式也很重要，目前有薄膜裝填法的保護柱，使用過程簡單方便，而且可以在實驗室中進行干裝。清洗方法：①以民丙醇作溶劑沖洗②放在異丙醇中超聲波清洗③用10%稀硝酸清洗如何選擇保護柱？怎樣選擇保護柱，但又不影響分離分析？通常，在選擇保護柱之前首先要考慮的是樣品是否清潔，對于大部分分析工作者來說，一只1cm長的保護柱便能提供充分的保護作用。長時間不用儀器，應該將柱子取上用堵頭封好保存，注意不能用純水保存柱子，而應該用有機相（如甲醇）保存，因為純水易長霉。確保每次做完實驗，所有流路中充滿純甲醇！ 色譜的保養(yǎng)：C18柱絕對不能進蛋白樣品、血樣，生物樣品。如流動相不含鹽，可對機器定期進行簡單的沖洗維護，根據(jù)實驗多少而定。色譜的保養(yǎng)：漏液處理：流路堵塞問題：緩沖鹽的使用：流動相含有鹽分時，做完實驗后一定要進行流路沖洗；首先用水沖洗，打開排液閥用PURG鍵轉換出原有含鹽的流動相，然后關閉排液閥打開泵沖洗全部流路45分鐘以上，如此更換流動相為水和甲醇混合液沖洗全部流路30分鐘（此步驟一般可省去，根據(jù)實驗而論），最后更換純甲醇沖洗全部流路45分鐘以上。工作站：出現(xiàn)死機可重起計算機；不正常運行時，首先可更換電腦測試其硬件故障；或在本機上重新插拔接口、重新安裝軟件。流通池：在色譜峰不正常時會可能是此部件補污染。排液閥：此處不能完全密封或漏液時一般是其中的墊片污染或磨損，可卸下后取出其墊片用異丙醇超聲波清洗