【正文】 細(xì)胞傳代培養(yǎng)（消化法）具體操作：一. 傳代前準(zhǔn)備：：把已經(jīng)配制好的裝有培養(yǎng)液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴鍋內(nèi)預(yù)熱。，并且要特別注意濾膜光面朝上。明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置，然后無菌分裝入50ml小瓶中， 4℃保存。所以制備過程中必須要注意無菌操作。分裝入10ml小瓶20℃保存。十. Ⅰ型膠原酶：％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配制和消毒滅菌。：含有肝素的培養(yǎng)液可以使內(nèi)皮細(xì)胞純度提高，肝素加入全培養(yǎng)液中最終濃度為50ug/ml?？梢耘渲?00mmol/L谷氨酰胺液貯存，用時加入培養(yǎng)液。加有谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應(yīng)重新加入原來的谷氨酰胺。在配制各種培養(yǎng)液中都應(yīng)該補加一定量的谷氨酰胺。如：，過濾除菌后可完全（20ml）加入1L培養(yǎng)液中，或者每100ml培養(yǎng)液中加入2ml即可。過濾除菌，分裝后4℃保存。使用終濃度為1050mmol/L，一般培養(yǎng)液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達(dá)到緩沖能力。對細(xì)胞無毒性作用。六．血清的滅火：細(xì)胞培養(yǎng)常用的是小牛血清，新買來的血清要在56℃水浴中滅火30分鐘后，再經(jīng)過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。：將過濾好的培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4℃冰箱內(nèi)待用。：配制好的培養(yǎng)液通常用濾器過濾除菌。：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。1單位＝1微克？：、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體積2/3的雙蒸水中,并用雙蒸水沖洗包裝袋23次(沖洗液一并加入培養(yǎng)基中),充分?jǐn)嚢柚练蹌┤咳芙? 使青鏈霉素的濃度最終各為100單位/ml。鏈霉素是100萬單位/瓶，加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。然后分裝成小瓶于20℃保存以備使用。攪拌混勻，置于4℃內(nèi)過夜。終止消化時，可用含有血清培養(yǎng)液或者胰酶抑制劑終止胰酶對細(xì)胞的作用。使用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細(xì)胞損傷。不同的組織或者細(xì)胞對胰酶的作用反應(yīng)不一樣。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉的水份。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純凈水(也可用于其它BSS，如：Hanks，DHanks液的配制)：：將藥品（NaCl：，KCl：，Na2HPO4?H2O：，KH2PO4：0. 2g）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中準(zhǔn)確定容至1000ml，搖勻即成新配制的PBS溶液。細(xì)胞培養(yǎng)用液的配制與消毒器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素. 純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計、磁力攪拌器。會腐蝕地面。安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾的作用。注意事項：嚴(yán)格執(zhí)行高壓鍋的操作規(guī)程：高壓消毒時，先檢查鍋內(nèi)是否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多因為其將使空氣流暢受阻，會降低高壓消毒效果。其法即用沾水筆或毛筆沾以密寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時__這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即出現(xiàn)字跡，從而可以判定它們是否消毒。用20000—100000rad的r射線消毒塑料制品效果最好。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子，放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。膠頭可用75％酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。膠塞烘干后用2％氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過的膠塞只要用沸水處理30分鐘），自來水洗凈，烘干。橡膠和塑料：橡膠和制品通常處理方法是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不同品質(zhì)進(jìn)行如下的處理程序：針式濾器帽不能泡酸液,用NaOH泡612小時,或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意光面朝上(凹向上)，然后將螺旋稍微擰松一些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75％酒精擦拭，再用自來水，然后用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度的上升安全閥冒出蒸氣，當(dāng)蒸氣成直線冒出35分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當(dāng)指針指向15磅時，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持2030分鐘即可。泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘附于玻璃上難以清洗），再用蒸餾水沖洗3次。高壓消毒：包裝好的器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，當(dāng)蒸氣成直線上升時，關(guān)閉安全閥，當(dāng)指針指向15磅時，維持2030分鐘。泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g：濃硫酸200ml：蒸餾水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿用自來水沖洗15次，最后蒸餾水沖洗35次和用雙蒸水過3次。烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。吸取兩種以上的使用液時要注意更換吸管，防止交叉污染。各種操作要靠近酒精燈，動作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。無菌操作的演示：凡是帶入超凈工作臺內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面靠近酒精燈火焰操作。實驗人員的無菌準(zhǔn)備：肥皂洗手。無菌操作無菌室的滅菌：定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3‰％過氧乙酸擦拭。培養(yǎng)室的設(shè)備：液氮罐、儲品柜（存放雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（80℃）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。 從最基礎(chǔ)的地方教起，一步一步詳細(xì)介紹細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，非常好的開門教程常用設(shè)備準(zhǔn)備室的設(shè)備：單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未消毒物品）、儲品柜（放置消毒過的物品）、包裝臺。我看到版上許多人養(yǎng)細(xì)胞遇到各種各樣的問題，很多時候bottleneck沒有找到，雖然通過其它方法有所改善，但仍然是事倍功半。但對于絕大部分胰酶或者EDTA溶液潤洗即可消化的細(xì)胞，不需要配制如此溶液。消化之前用PBS洗滌，是常見的操作，因為Serum含有抑制trypsin的蛋白。一般不要試圖延長消化時間（如果10min還消化不徹底的話），而應(yīng)該想其它辦法。這里要明白，trypsin切割ECM的一些負(fù)責(zé)粘連和附著的蛋白，而EDTA通過螯合Ca離子，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加溫和。6，EDTA的作用。這個時候都不用胰酶消化，用一些鹽溶液（不是EDTA液）即可。但少數(shù)實驗，比如病毒包裝，對細(xì)胞代數(shù)，對細(xì)胞狀態(tài)要求極高。一些正常細(xì)胞也會有難消化的時候，比如tsDC細(xì)胞，但也只要用少量胰酶孵育，3min左右即可看到成片沙狀移動。4，比較難消化的細(xì)胞（潤洗方法5min還不能消化），就以colon cancer為例，比如HCT15, LS411和KM12，這樣的細(xì)胞一般需要用少量胰酶孵育，但也不需要很多，一般100 mm dish，一次最多加入500ul，就足夠了，一般我加300ul。如果和標(biāo)準(zhǔn)形態(tài)不一致，那可能是自己沒消化好導(dǎo)致的，但如果消化方法正確，仍然成片分布，甚至完全吹打成單細(xì)胞懸液，貼壁后仍然成片分布，這是細(xì)胞的特性，是因為貼壁過程中重新聚集了。比如Caco2其實是很好消化的細(xì)胞，不需要胰酶孵育即可，只是有點成片分布。但我估計這個方法可能對付少數(shù)非常怪異的細(xì)胞才需要這么復(fù)雜的程序。細(xì)胞只要能從基質(zhì)上脫離下來，這個時候即使是成片的（比如Calu3細(xì)胞），吹打不超過20次后（一般10次即可），成小規(guī)模聚集（10個細(xì)胞左右），是正常的，不要試圖再去延長消化時間，或者象有的同學(xué)那樣吹打1h，等待單細(xì)胞懸液出現(xiàn)。細(xì)胞就是完全成單個細(xì)胞懸液，之后在貼壁的過程中仍然會聚集，這個是貼壁培養(yǎng)的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞的一個特性，無論死活的細(xì)胞都是如此，你可以嘗試，準(zhǔn)備100%的單個細(xì)胞懸液，貼壁后觀察細(xì)胞，仍然是幾個幾個細(xì)胞聚集在一起。一般能移動了，說明細(xì)胞與培養(yǎng)基質(zhì)材料的附著已經(jīng)消失了，細(xì)胞之間的附著也已經(jīng)消失了，細(xì)胞已經(jīng)獨立分布了（雖然沒有呈現(xiàn)很廣的離散分布）。簡單的程序是PBS潤洗吸去，胰酶潤洗吸去，然后37度消化。一般的程序步驟，細(xì)節(jié)操作，我這里就不講了，只講一些基本操作背后的知識，如果不對之處，歡迎指正，一起討論：1，其實絕大部分細(xì)胞消化的時候是只要用胰酶潤洗一遍即可，吸去胰酶后，殘留的那些無法計算體積的附著在細(xì)胞表面的微量胰酶在37度一般不到2min足夠消化細(xì)胞（絕大部分1min不到）。許多同學(xué)對細(xì)胞消化做了許多研究，得出了很多有價值的經(jīng)驗，也見到很多人的困惑。細(xì)胞培養(yǎng)集錦(一個培養(yǎng)300多種細(xì)胞人的經(jīng)驗總結(jié))一、消化與吹打版上很多朋友討論細(xì)胞培養(yǎng)問題，見到很多很好的經(jīng)驗總結(jié)，這里說一些我個人的經(jīng)驗，因為一些比較特殊的原因，我自己培養(yǎng)接觸過近300種細(xì)胞，常用于做實驗的，累積有百余種，可以說遇到過許多各式各樣古怪的細(xì)胞。這里挑細(xì)胞消化開始做我的第一篇專題，并不是因為細(xì)胞消化最重要，而是近期看到大家頻繁討論這個話題，我就拋磚引玉，下面幾點拙見，可能與其它朋友總結(jié)的一些經(jīng)驗有點出入，僅供大家參考。其實細(xì)胞培養(yǎng)，尤其是細(xì)胞系的培養(yǎng)，就消化而言，不是太難，做得多了，善于總結(jié)經(jīng)驗，就能把細(xì)胞越養(yǎng)越好。對于這些細(xì)胞原則上不要用胰酶孵育細(xì)胞，連續(xù)這樣傳代，對細(xì)胞傷害很大。2，什么算是消化好了呢？不是細(xì)胞全部成間隔分布很離散的單個圓形才算消化好了，一般你肉眼觀察貼壁細(xì)胞層，只要能移動了，多半呈沙壯移動，其實已經(jīng)可以了，很多人喜歡把細(xì)胞消化或者吹打成完全分離細(xì)胞，這是沒有必要的。這個時候應(yīng)該停止消化，不要等到看到鏡下所有細(xì)胞都分離得非常好，間隙很大，才停止。一些懸浮培養(yǎng)細(xì)胞也是如此，容易聚集，不要去嘗試過幾個小時就拿出來吹打成單細(xì)胞懸液（不要笑，這個是初養(yǎng)懸浮細(xì)胞的人常犯的錯誤，以為懸浮培養(yǎng)就是一個一個分開）。3，另一個帖子里提到一個比較復(fù)雜的四步消化法，這個挺有意思，我也是第一次聽說，應(yīng)該是網(wǎng)友自己發(fā)展出來的方法，很有參考價值。我目前養(yǎng)過的近300株細(xì)胞里面，還沒遇到這么怪異的。不要以為成片分布是自己沒養(yǎng)好，這個視細(xì)胞而定。這個時候你拼了命要去讓它均勻分布，你的細(xì)胞之后會對你越來越不好。即使這樣難消化的細(xì)胞，一般不超過5min，即可見細(xì)胞成片移動，就應(yīng)該停止消化。5，常規(guī)的細(xì)胞實驗（增殖，凋亡，遷移，分化之類的），受消化影響不是很大，如果不用胰酶去孵育而使用潤洗的方法消化的話（難消化細(xì)胞例外）。這個時候，胰酶消化，就是潤洗，都會對細(xì)胞包裝病毒的能力有影響，傳代次數(shù)一多，細(xì)胞包裝能力就會逐漸下降（當(dāng)然也有其它因素影響包裝效率）。這些鹽溶液通過影響ECM相關(guān)酶的活性，來使得細(xì)胞脫離基質(zhì)附著表面，但不切割任何蛋白。許多人不用胰酶，只用EDTA，或者用trypsin/EDTA聯(lián)合作用。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者對付特別難消化的細(xì)胞，添加多一些EDTA，就是這個道理。7，PBS洗滌。但這里面也有學(xué)問可以講，對于一些難消化細(xì)胞，那么可以配制不含Ca，Mg離子的PBS，因為這些離子也會抑制trypsin的活性?？偨Y(jié)下來，雖然這個帖子是關(guān)于消化的，但其實消化并不是細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵所在（雖然很重要），關(guān)鍵所在是細(xì)胞來源，血清質(zhì)量和水源（自己配制溶液的話）。因為人們往往注意自己的操作，總覺得自己沒有經(jīng)驗，而忽視試劑，溶液尤其是細(xì)胞的質(zhì)量，后者其實才是許多細(xì)胞培養(yǎng)實驗室常見的問題。配液室的設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥品）、PH計（測量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配置溶液室攪拌溶液）。必須放在無菌間的設(shè)備：離心機（收集細(xì)胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4℃冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3‰新潔爾滅擦拭，然后用75％％過氧乙酸，再用紫外燈照射實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各2030分鐘實驗后滅菌：用75％酒精（3‰新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡的載物臺。穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋用75％酒精棉球擦凈雙手。器皿使用前必須過火滅菌繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。如吸管不能碰到廢液缸。器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新的玻璃器皿的洗消：自來水刷洗，除去灰塵。刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。高壓消毒后烘干二、舊的玻璃器皿的洗消：刷洗、烘干：使用過的玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）的器皿要用清水刷洗干凈，然后烘干。烘干、包裝：洗干凈的器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及防止灰塵和再次被污染。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）烘干備用：因為高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，所以要放入烤箱內(nèi)烘干備用。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。注意在超凈臺內(nèi)取出使用時應(yīng)該立即將螺旋旋緊。然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。膠帽，離心管帽烘干后只能在2％氫氧化鈉溶液中浸泡612小時（切記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：其他消毒方法：有的物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70％酒精浸泡消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用2—3周時間洗除殘留的氧化乙烯。為了防止清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標(biāo)記。密寫墨水的配制：氯化鉆(CoC12?6H2O)2g，30％鹽酸10m1，蒸餾水88m1。檢查安全閥是否通暢，以防高壓時爆炸。注意人體的防護(hù)和器皿的完全浸泡：，防止酸液濺起傷害人體。不能留有氣泡，以防止泡酸不徹底。具體步驟：一. 水的制備：細(xì)胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不含有離子和其他的雜質(zhì)。：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20分鐘。三. 胰蛋白酶溶