【正文】 長和GSH的積累均有利。GSH 是一種含氮量(%)較高的物質(zhì)，因此在生物合成GSH 的過程中，合適的氮源供給是非常必要的。應(yīng)用計(jì)算得出的一種以控制比生長速率為目的的搖瓶補(bǔ)糖策略。在5 L發(fā)酵罐上進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵結(jié)束后GSH產(chǎn)量、。饒志明，艾麗靜等[33]分別選擇葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉作為碳源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在以甘油為碳源的培養(yǎng)基上，重組畢赤氏酵母的生物量及GSH含量均達(dá)最高值。由于葡萄糖是速效碳源, 它的初始濃度對GSH的積累非常重要，時(shí)麗萍，郭學(xué)武等[32]考察不同的葡萄糖初始濃度對酵母中GSH積累的影響，結(jié)果顯示，當(dāng)初糖濃度逐漸升高時(shí)，生物量在增加，但GSH的含量卻在降低。Chi Hsien等[30]認(rèn)為葡萄糖是啤酒酵母()生長的最佳碳源，蛋白胨是最佳氮源。二、發(fā)酵過程的優(yōu)化及放大① 培養(yǎng)基碳源日本學(xué)者Sakato[29]研究表明，葡萄糖添加是工業(yè)化生產(chǎn)GSH的關(guān)鍵因素之一。Kono等[28]用產(chǎn)朊假絲酵母經(jīng)紫外線、x射線或亞硝基胍作用，得到的蛋氨酸耐性突變株，再經(jīng)同樣處理，得到同時(shí)耐亞硫酸鹽和乙硫氨酸的變異株，%，%。浙江工業(yè)大學(xué)賈建萍、裘娟萍[26]以編號(hào)為346的釀酒酵母為出發(fā)菌株，通過紫外線和60Co射線誘變處理， 4005，較出發(fā)菌株提高350%，%。一、菌種選育%，但有一些酵母菌，如Saccharomyces glyoxalphilus、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)和 Saccharomyces cystinovolens、 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，其菌體內(nèi)GSH含量較高，且能長時(shí)間保持合成GSH的能力[17]。GSH市場需求較大，但由于酵母細(xì)胞的GSH含量較低(%～%)、酵母用量大、收率低等缺點(diǎn)，現(xiàn)有生產(chǎn)能力不能滿足市場需求，所以加緊對發(fā)酵法生產(chǎn)GSH的研究已成為國內(nèi)當(dāng)務(wù)之急。目前實(shí)現(xiàn)GSH規(guī)模生產(chǎn)的國家是日本。即構(gòu)建GSH合成能力強(qiáng)和胞內(nèi)含量高的微生物，篩選和優(yōu)化培養(yǎng)組分，改進(jìn)提取工藝，最終提高GSH的產(chǎn)率和質(zhì)量。其中發(fā)酵法是最具潛力的方法。 發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的國內(nèi)外研究動(dòng)態(tài)由于GSH具有重要的生理功能和廣泛的市場前景，因此GSH的工業(yè)化生產(chǎn)越來越受到關(guān)注。人體中如缺乏GSH可以引起肺部疾病、胃腸疾病、胰臟炎癥、神經(jīng)變性疾病、加速衰老等癥狀[22]，近年來發(fā)現(xiàn)，GSH的缺乏還會(huì)導(dǎo)致小兒惡性營養(yǎng)不良癥、癲癇發(fā)作、帕金森綜合癥、囊性纖維化、鐮狀細(xì)胞性貧血、人體免疫缺損病毒入侵、艾滋病、癌癥、心臟病、中風(fēng)、糖尿病等疾病[23]。GSH高濃度存在于眼組織的 水晶體、角膜、視神經(jīng)、視網(wǎng)膜及睫狀體內(nèi)，有益于角膜或水晶體透明性的維持以及組織再生與修復(fù)。(4) 可以防止皮膚黑色素沉積，防止新的黑色素形成并減少其氧化[20]。(3) 解除中毒，減輕空氣污染和食物中的有毒成分對人體造成的傷害。(2) 治療腫瘤，減輕化療和放療的副作用[18]。GSH在臨床應(yīng)用上具體表現(xiàn)為：(1) 保護(hù)肝臟，治療各種肝類疾病[16]。GSH分子中含有一個(gè)特異的γ肽鍵，由谷氨酸的γ羧基與半胱氨酸的α氨基縮合而成，并且半胱氨酸側(cè)鏈基團(tuán)上連有一個(gè)活潑巰基，是GSH許多重要生理功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。機(jī)體內(nèi)新陳代謝產(chǎn)生的許多自由基會(huì)損傷細(xì)胞膜，侵襲大分子，促進(jìn)機(jī)體衰老，并誘發(fā)疾病的產(chǎn)生。GSSH是由兩分子GSH經(jīng)氧化脫氫而形成的以二硫鍵連接的二聚體，一般以水合物的形式存在。早在1921年，Hopkins首先發(fā)現(xiàn)GSH，它分為還原型GSH和氧化型GSSH兩類[8]。二甲基甲酰胺，但微溶于醇、醚和丙酮等有機(jī)溶劑。比旋光度[α]為+176。Bloch最早在肝臟中研究了GSH的生物合成，并證實(shí)了細(xì)胞內(nèi)的GSH是由LGlu、LCys和Gly在ATP的存在下，經(jīng)過γL谷氨酰半胱氨酸合成酶和GSH合成酶催化的序貫反應(yīng)合成的。 谷胱甘肽概述 谷胱甘肽結(jié)構(gòu)和性質(zhì)谷胱甘肽，是由L谷氨酸、L半胱氨酸和甘氨酸組成的生物活性三肽化合物[1]，廣泛存在于生物體內(nèi)的最豐富的非蛋白硫醇化合物[2]。如果人體免疫能力強(qiáng)，就算被感染上病毒，也會(huì)將病毒的侵害降低到最低限度。GSH是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過肽鍵縮合而成，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值，具有保肝、抗氧化的作用，含有豐富的氨基酸、肽類物質(zhì)、維生素、微量元素。關(guān)鍵詞： 啤酒酵母Y14，谷胱甘肽，發(fā)酵罐，D001大孔樹脂，SephadexG10AbstractGlutathione (GSH) is a tripeptide formed by glutamic acid, cysteine and glycin, it has important physiological functions such as removing free radical, detoxification, antiaging, diabetes and cancer prevention, inhibition of HIV and improve the effectiveness of the human immune system, and has a wide range of market prospects in the fields of medical, food and cosmetics. But the existing production capacity of GSH is far from the market microbial fermentation to translate cheap raw materials into high yielded GSH, and establish suitable industrialization separation and purification of GSH will bring enormous social and economic benefits. In this paper, the main research content and results are as follows:(1) Using PlackettBurman and BoxBehnken experimental design optimized medium of Saccharomyces cerevisiae Y14 which producing GSH. The optimum medium was glucose 20g/mL, yeast extract 10g/mL, (NH4)2SO4 8 g/mL, KH2PO4 3 g/mL, MgSO4 g/mL. The optimum experiment showed that GSH yield reached to (2) Using single factor test studied the fermentation conditions of yeast Y14 producing GSH. The optimum shakeflask fermentation conditions was culture temperature 30 ℃, initial , shake speed 180rpm, liquid volume 30mL / 300mL, medium batch add time 20h. GSH content reached to , GSH yield reached to , increased 102% pare to the original.(3) Using 10L automated fermentor, ① using single constant speed fed glucose medium, added precursors of amino acids and ATP at 20h, and the GSH yield reached to maximum 243mg /L at 52h. ② using constant flow increases total nutrient medium, added fed medium at 36h , GSH yield maximum reached to (4) Using D001 macroporous resin rough to separate GSH, the optimum separation conditions was:sample , sample concentration was , sample flow rate of , impurities washing liquid was absolute alcohol, eluate was % HCl and mol/L NaCl, elution flow rate was 3mL/min, the average yield of GSH was %, protein removal rate was %. Then using Sephadex G10 to desalt and purify GSH, the optimum conditions was:25cm chromatography columns, sample concentration was , sample volume was 20mL. The average yield of GSH was %. In the end,using Sephadex G10 to purify GSH, using 50cm chromatography columns, the optimum sample volume was 2mL, the average yield of GSH was %, protein removal rate was %. The average of concentration multiple and purification multiple was and respectively.Keywords：Saccharomyces cerevisiae Y14, Glutathione, Fermentor, D001 macroporous resin, Sephadex G10目 錄摘 要 IAbstract II目 錄 III第1章 引 言 1 谷胱甘肽概述 1 谷胱甘肽結(jié)構(gòu)和性質(zhì) 1 谷胱甘肽的生理功能及其應(yīng)用 3 發(fā)酵法生產(chǎn)谷胱甘肽的國內(nèi)外研究動(dòng)態(tài) 4 本研究的意義、目的及內(nèi)容 9 意義 9 目的 9 研究內(nèi)容 10 常用研究指標(biāo)的說明 10第2章 啤酒酵母Y14發(fā)酵GSH培養(yǎng)基的優(yōu)化 11 材料 11 菌種： 11 培養(yǎng)基： 11 主要試劑 12 主要儀器 12 方法 12 菌株活化 13 種子搖瓶培養(yǎng) 13 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng) 13 菌種的保藏 13 DTNB法檢測GSH含量 13 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法 13 結(jié)果與分析 14 顯著影響因素的篩選結(jié)果 14 BoxBehnken設(shè)計(jì)進(jìn)一步優(yōu)化培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果 16 結(jié)論 19第3章 啤酒酵母Y14產(chǎn)GSH發(fā)酵條件的優(yōu)化 20 材料 20 菌種： 20 培養(yǎng)基： 20 主要試劑 21 主要儀器 21 方法 21 啤酒酵母Y14生長曲線的測定 21 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn) 21 發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn) 21 發(fā)酵初始pH的優(yōu)選試驗(yàn) 22 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn) 22 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn) 22 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH的進(jìn)程試驗(yàn) 22 結(jié)果與分析 22 啤酒酵母Y14生長曲線的繪制 22 發(fā)酵周期的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 23 發(fā)酵溫度的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 24 發(fā)酵初始pH值的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 24 發(fā)酵搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 25 發(fā)酵搖瓶裝液量的優(yōu)選試驗(yàn)結(jié)果 26 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)GSH進(jìn)程曲線的繪制 27 結(jié)論 28第4章10L自動(dòng)發(fā)酵罐擴(kuò)大發(fā)酵的初探 29 材料 29 菌種： 29 培養(yǎng)基 29 主要試劑 30 主要儀器 30 方法 30 斜面種子培養(yǎng) 30 一級(jí)種子搖瓶培養(yǎng) 31 二級(jí)種子搖瓶培養(yǎng) 31 31 分析方法 31 結(jié)果與討論 32 第一批發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) 32 第二批發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng) 36 結(jié)論 40第5章 啤酒酵母Y14中還原型GSH的分離純化 41 材料 41 菌種 41 主要材料 42 主要設(shè)備 42 方法 42 GSH提取液的制備 42 檢測方法 42 相關(guān)數(shù)據(jù)的計(jì)算公式 42 D001大孔樹脂離子交換柱的試驗(yàn)流程 43 D001大孔樹脂分離GSH的研究 43 SephadexG10凝膠柱的試驗(yàn)流程 44 SephadexG10純化GSH的研究 45 46 D001大孔樹脂分離GSH的研究結(jié)果 46 SephadexG10脫鹽純化GSH的研究結(jié)果 50 SephadexG10分級(jí)分離純化GSH的研究結(jié)果 53 結(jié)論 56第6章 總結(jié)與展望 57 總結(jié) 57 創(chuàng)新點(diǎn) 58 展望 58參考文獻(xiàn) 59致 謝 64附 錄 65第1章 引 言據(jù)報(bào)道，人體內(nèi)有一種神奇的物質(zhì)，它和人的健康狀況有直接的關(guān)系。%。%，%。比較發(fā)現(xiàn)，第二批發(fā)酵罐培養(yǎng)菌體干重、%、%。(3) 利用10L自動(dòng)發(fā)酵罐補(bǔ)料培養(yǎng)啤酒酵母Y14，①采用恒速流加單一葡萄糖培養(yǎng)基，20h時(shí)添加前體氨基酸和ATP的方法，測得GSH的產(chǎn)量在52h時(shí)，達(dá)到最大值243mg/L。(2) 利用單因