【正文】 菌 SL98 最佳的培養(yǎng)基配方對(duì)其主要的幾種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn) 行了考察。發(fā)酵初期較高的有機(jī)氮源 豆餅粉有利于林可霉素的生長(zhǎng)和生產(chǎn)能力的提高。次級(jí)代謝產(chǎn)物的合成與培養(yǎng)基中的氮源種類、含量和代謝途徑等也有很大關(guān)系 。這時(shí)微生物會(huì)表現(xiàn)出“二次生長(zhǎng)現(xiàn)象” [15]。在特殊情況下 (如碳源貧乏時(shí) )，蛋白質(zhì)水解物或氨基酸等也可作為碳源使用。 C、 N源 是微生物生長(zhǎng)必不可少的兩大營(yíng)養(yǎng)元素。到接種與發(fā)酵培養(yǎng) 時(shí)其 pH一般可達(dá)到 。在培養(yǎng)的過程中 pH 會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間有所上升但中間有一個(gè)下降的過程，這可能是菌體 在 生長(zhǎng)過程中對(duì)葡 萄糖 的 利用 而 使 pH 有所下降。 從 圖 21 中看出，在 24h 時(shí)，菌絲體僅呈分支狀，在 36h 菌絲體明顯增多，到 48h后已經(jīng)可以看出大量菌絲團(tuán)的存在，在 54h時(shí)更可以看出菌團(tuán)里的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)已經(jīng)被大量李陽 林肯鏈霉菌產(chǎn) 林可霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基 的優(yōu)化 10 的消耗。 通常，接種齡以菌絲處于生命力極為旺盛的對(duì)數(shù)期較為合適。 菌濃＝ [10－上清液（ mL） ]/10 100% 安徽學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) （ 論文 ） 9 第 二 章 結(jié)果與討論 種子 培養(yǎng) 林可霉素的 種子 培養(yǎng) 基 用來擴(kuò)大發(fā)酵種子量的，種子質(zhì)量的好壞和種子量都直接關(guān)系發(fā)酵產(chǎn)物效價(jià)的高低。 效價(jià)計(jì)算： 李陽 林肯鏈霉菌產(chǎn) 林可霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基 的優(yōu)化 8 直接代入計(jì)算公式： lgθ=V/WlgK =[(UH+UL)(SH+SL)]/[(SH+UH)(SL+UL)]lg(H/L) （式 12） Pu=θPs （式 13） K=H/L （式 13） 式中 SH為標(biāo)準(zhǔn)品的高劑量 稀釋液（ ）的抑菌圈直徑； SL為標(biāo)準(zhǔn)品的低劑量稀釋液（ ）的抑菌圈直徑； UH為待檢品的高劑量稀釋液的抑菌圈直徑； UL為待檢品的低劑量稀釋液的抑菌圈直徑； θ 為相對(duì)效價(jià)（待檢品效價(jià)與標(biāo)準(zhǔn)效價(jià)之比）； PS為標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)； PU為待檢品效價(jià)； K為高劑量（ H）與低劑量（ L）之比。 換陶土蓋：從無菌操作下取下培養(yǎng)皿蓋，立即換上已滅菌的陶土蓋，平放 37?C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng) 1824h，觀察結(jié)果。用無菌鑷子夾取牛 津杯的 果 部，將其分別輕放在四個(gè)區(qū)的中央，用鑷子輕輕 圖 12效價(jià) 測(cè)量 按牛津杯使其與培養(yǎng)基表面緊密接觸，但不能穿破培養(yǎng)基。制備含菌薄層平板，先用 2mL無菌吸管吸 取 50?C保溫 的 100mL營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，再用無菌大 口吸管吸取 6mL加至已冷凝底層培養(yǎng)基，立即搖勻。 待檢樣品溶液的配制 待檢 樣品溶液按標(biāo)準(zhǔn)溶液的配方進(jìn)行配制，最終得到的高、低濃度與標(biāo)準(zhǔn)品的兩種濃度相近。 林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精確稱量林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品 （177。 試驗(yàn)菌株的培養(yǎng) 在營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上接藤黃八疊球菌， 37?C培養(yǎng) 18－ 24h，用無菌生理鹽水洗下，儲(chǔ)存于冰箱中待用。 藤黃八疊球菌 、 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 、 林可霉素標(biāo)準(zhǔn)品 、 林可霉素待檢品 、 牛津杯（不銹鋼管要求規(guī)格一致） 、 培養(yǎng)皿 、 無菌吸管 、 鑷子 、 陶瓦蓋 、 游標(biāo)卡尺 、 容量瓶 、 蒸餾水等。 y = R 2 = 0 1 2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 還原糖含量 （ g/100mL） Na2S2O4 安徽學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) （ 論文 ） 7 二劑量法是利用抗生素濃度的對(duì)數(shù)值與抑菌圈成直線關(guān)系的原理，將抗生素的標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品各稀釋為一定的比例的兩種劑量，即高劑量和低 劑量（ 2： 1或 4： 1），在同一平板上進(jìn)行比較，根據(jù)它們產(chǎn)生的抑菌圈直徑的大小，按照公式計(jì)算出待檢品的效價(jià)。管碟法的原理是利用抗生素在培養(yǎng)基 內(nèi)擴(kuò)散滲透作用，比較標(biāo)準(zhǔn)品和待檢品兩者對(duì)試驗(yàn)菌產(chǎn)生的抑菌圈的大小，以決定待檢抗生素的效價(jià)?，F(xiàn)在大多數(shù)采用微生物方法，因其用量少，靈敏度高。還原糖樣品測(cè)定計(jì)算：以（ V 空白 V 樣品 ）的值查葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖得葡萄糖量或利用線性方程計(jì)算出葡萄量，即可得到樣品的還原糖會(huì)含量（ g/100mL）。 圖 11 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 還原糖的測(cè)量 將發(fā)酵液離心分離，取出上清液 1mL(如含糖量較高則取 )于 150mL 三角燒瓶中，加蒸餾水 10mL，搖勻后準(zhǔn)確加入斐林試劑 20mL，再 煮沸 3min(準(zhǔn)確計(jì)時(shí) )， 冷卻后加入 6mol/L HCL10mL， 立即以 (已經(jīng)標(biāo)定 )滴定至淡黃色，加淀粉指示劑 1mL， 繼續(xù)滴定到黃色褪去即為終點(diǎn)，讀取 毫升數(shù) 。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液的體積 。 將 A液和 B液混合搖勻后，加入 C液充分振蕩即可。 B 液：稱取 250g NaOH 和 375g 酒石酸鉀鈉 ， 用蒸餾水溶解并稀釋至 2022mL（ NaOH溶解時(shí)要緩慢加入）。 ）分析純葡萄糖于 100mL容量瓶中，加水溶解，定容，搖勻。 計(jì)算公式： 氨基氮含量（ N， mg/100mL） =M*V1*m*100/V2 =* V1*14*100/ = （式 11） [11] 在發(fā)酵過程分析淀粉和葡萄糖，通 過酸水解作用，淀粉可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖，單糖分子中的醛基具有還原性，在堿性溶液中能將二價(jià)銅離子還原為亞銅離子，剩余的銅在酸性溶液中與碘化鉀反應(yīng)，析出游離碘用標(biāo)準(zhǔn)硫代硫酸鈉溶液滴定，從空白與樣品所消耗的 NaS2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液得體積的差值，推算糖的含量 (以葡萄糖計(jì) )，測(cè)定中用到的 Cu2+， KI，事先配制堿性溶液，稱為斐林試劑 .斐林試劑為一堿性 Cu2+試劑，內(nèi)含 Cu2+、 KI， NaOH 及酒石酸鉀鈉，酒石酸鉀鈉的作用是 與 Cu2+生成絡(luò)合物，避免 Cu2+在堿性溶液中生成 Cu(OH)2沉淀。 %的甲基紅批示劑的配制 取甲基紅 ， 再加水稀釋至 200mL得到的變色范圍 pH為 (紅變黃 )。 中性甲醛溶液 在 50mL 36%37%(質(zhì)量分?jǐn)?shù) ) 甲醛溶液中加入 1mL %酚酞乙醇水溶液，用，貯于密閉的玻璃瓶中 ， 此試劑在使用前配制 。 4NH4++6HCHO= (CH2)6NH++6H2O+3H+ NaOH + H+=Na++H2O 安徽學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) （ 論文 ） 5 試劑與器材 1NHCl 取在盛有 917mL 的蒸餾水的試劑瓶中 ， 緩緩加入 83mL濃鹽酸 ， 待冷卻后定溶搖勻 。 分析測(cè)定方法 [10] 原 理 利用甲醛法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果是氨基氮和氨 鹽氮含量的總和。 待 種子 生長(zhǎng)到一定階段 （達(dá)到接種指標(biāo) 后） ， 接入發(fā)酵培養(yǎng)基中 （接種量 6%） 培養(yǎng) 。 當(dāng) 還原糖 含量為 、氨基氮 為 6080mg/mL、菌濃 為 2228%、 pH 為－ 。 種子 培養(yǎng) 方法 種子 培養(yǎng)基按 制后 ， 裝量： 25mL/250mL， 50mL/500mL。 試驗(yàn)方法 斜面培養(yǎng) 方法 將生長(zhǎng)良好、孢子豐滿，沒有受到雜菌污染的單菌落用接種針將其挑入斜面，均勻的涂滿斜面，把斜面放入恒溫培養(yǎng)箱 在溫度 ?C、濕度 35%條件下培養(yǎng) 。 （測(cè)量效價(jià)培養(yǎng)基）的配制 蛋白胨 6g/L、 酵母膏 6g/L、 牛肉膏 、 葡萄糖 1g/L、 瓊脂 15g/L， 。 ,種子 培養(yǎng)基裝量 10%。 培養(yǎng)基長(zhǎng)度 1/ C 總 ， C 還 ，NH2N 1016mg/100mL。 試驗(yàn) 藥品 表 12主要試劑 試驗(yàn)藥品 產(chǎn)家 硫酸銨 磷酸二氫鉀 淀粉 葡萄糖 AR L酪氨酸 酚酞 C20H14O4 蛋白胨 BR 蔗糖 上海試劑一廠綜合經(jīng)營(yíng)公司經(jīng)銷 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 菱湖精細(xì)化工廠 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 中國(guó)惠興生化試劑有限公司 天律市化學(xué)試劑一廠 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司 國(guó)藥集團(tuán) 化學(xué)試劑有限公司 其他藥品還有 豆粉、碳酸鈣、玉米漿、氯化鈉、硝酸鈉、 KNO3 、 FeSO4?7H2O、 MgSO瓊脂（寶石牌） 等 。 安徽學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) （ 論文 ） 3 第 一 章 材料與 方法 試驗(yàn)菌 林肯鏈霉菌 SL9藤黃八疊球菌 （由安徽工程科技學(xué)院生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供） 。 鑒于碳氮源 、磷酸鹽和前體物質(zhì)的重要性。正因?yàn)榕囵B(yǎng)基在生產(chǎn)中的重要地位，培養(yǎng)基的優(yōu)化也成為目前研究的重點(diǎn) ， 如童婷[8]、周曉榮 [9]所 做的關(guān)于培養(yǎng)基成份的優(yōu)化 等 方面的 研究 。國(guó)內(nèi)大部分研究 的 是其工業(yè)應(yīng)用方面，如菌種 的 誘變篩選等 [57]。林可霉素作為臨床應(yīng)用 的主要抗生素也是人們研究 的 熱點(diǎn)。兩組分在結(jié)構(gòu)上的區(qū)別為： A 組分在 4 位上為正丙基，而 B組分為乙基 ， B組分無抑菌作用。 因此林可霉素 具有很重要的藥用價(jià)值， 同時(shí) 在工業(yè)上也 具有 很重要的經(jīng)濟(jì)價(jià) 值。 林可霉素一種林可胺類抗生素，對(duì)多數(shù)革蘭氏陽性菌有較強(qiáng)抑菌活性，特別是對(duì)鏈球菌、肺炎球菌、金黃色葡萄球菌及厭氧菌的抗菌作用尤為明顯。安徽學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì) （ 論文 ） 1 表格清單 表 11 主要儀器 4 表 12 主要試劑 4 表 21 種子 代謝狀況 10 表 22 正交試驗(yàn)的因素水平表 11 表 23 正交試驗(yàn) L9(34)結(jié)果處理 12 表 24 磷酸二氫鉀 對(duì)產(chǎn)生林可霉素的影響 結(jié)果 13 表 35 前體酪氨酸 對(duì)產(chǎn)生林可霉素的影響 測(cè)量結(jié)果 14 圖表清單 圖 1 林可霉素結(jié)構(gòu)式 3 圖 11 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 7 圖 12 平板效價(jià)圖 8 圖 21 菌種在不同時(shí)期的菌體狀態(tài) 10 圖 22 不同時(shí)間 正交試驗(yàn)結(jié)果 線形 圖 13 圖 23 磷酸二氫鉀對(duì) 產(chǎn)生 林可霉素的影響 結(jié)果柱形圖 14 圖 24 前體酪氨酸 對(duì)產(chǎn)生林可霉素的影響測(cè)量結(jié) 果柱形 圖 16 李陽 林肯鏈霉菌產(chǎn) 林可霉素發(fā)酵培養(yǎng) 基 的優(yōu)化 2 引 言 林肯鏈霉菌是放線菌屬中鏈霉菌的一種，基絲無橫隔，直徑大約為 m?？僧a(chǎn)生一種林可胺類堿性物質(zhì) 林可霉素。在人體內(nèi)分布廣泛，對(duì)于呼吸系統(tǒng)、骨髓炎及軟組織感染等疾病有很好的治療作用，尤其適用于對(duì)青霉素過敏的病人 [1]。 林可霉素含 A、 B 兩組分，其主要成分為 A 組分，分子式為 C18H34N2O6S，相對(duì)分子量為 ， 其結(jié)構(gòu)見圖 1。 在當(dāng)今科技發(fā)達(dá) 的 時(shí)代，生物產(chǎn)品已經(jīng)成為時(shí)代 的 主流。目前國(guó)外對(duì)林 可霉素 的 研究主要集中在基因調(diào)控、代謝及作用機(jī)理方面 的 研究 [24]。 但是一個(gè)好的菌株出現(xiàn)，不僅僅是誘變篩選的結(jié)