【正文】 ? 由于蛋白質(zhì)在等電點時最易沉淀，故可選擇等電點的pH作為鹽析 pH 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 幾種蛋白質(zhì)析出時所需硫酸銨的離子的強度 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 不同鹽溶液中碳氧血紅蛋白的溶解度與離子強度的關(guān)系 不同鹽溶液中碳氧血紅蛋白的溶解度與離子強度的關(guān)系（ 25℃ ） (○ )NaCl。 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 鹽析法原理 ? 鹽析法分離蛋白質(zhì)時，可分兩類： 1）在一定的 pH值和溫度下，改變離子強度或鹽濃度的沉淀方法 ——“K”分級鹽析法 2）在一定離子強度下，改變?nèi)芤旱?pH值及溫度的沉淀方法 ——“?”分級鹽析法 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 鹽析的主要影響因素 ?鹽溶 (salting in)： 許多蛋白在低鹽濃度下發(fā)生鹽溶現(xiàn)象（比在純水中的溶解度大大增加）； ? 高鹽濃度則鹽析，離子強度越大，蛋白質(zhì)的溶解度越低； ? 鹽析劑種類很多，不同種類的鹽對蛋白溶解度的影響是不同的；離子半徑小且電荷高的離子對鹽析作用的影響較強，離子半徑較大而電荷低的離子影響較弱；不同種類的鹽對溶解度的影響，主要是對 Ks值的影響， Ks值越大，該鹽的鹽析效果越好。I logS=β KsI S — 離子強度為 I時的蛋白溶解度 (g/L)。 1. 鹽析法的原理 2. 鹽析法的影響因素 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 鹽析法的原理 ? 原理： ①鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，降低了用于溶解蛋白質(zhì)的有效水量，減弱了蛋白質(zhì)的水合程度，破壞了蛋白表面的水化膜，導致蛋白質(zhì)溶解度下降； ②鹽離子電荷的中和作用，使蛋白質(zhì)溶解度下降； ③鹽離子引起原本在蛋白質(zhì)分子周圍有序排列的水分子的極化，使水活度降低。 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 等電點沉淀法 ? 等電點沉淀法的適用范圍： ① 明確 pI的兩性物質(zhì)； ② 疏水性較大的蛋白質(zhì)。 ? 堿性磷酸酯酶的 pI沉淀提?。喊l(fā)酵液調(diào) 性磷酸酯酶的沉淀物，離心收集沉淀物。 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 等電點沉淀法的實例 ? 從豬胰臟中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的 pI＝ ，可先于 pH ，除去共存的許多酸性蛋白質(zhì) (pI=)。 ? 沉淀法的分類： 一． 等電點沉淀法 二． 鹽析法 三． 有機溶劑沉淀法 四． 非離子型聚合物沉淀法 五． 聚電解質(zhì)沉淀法 六． 生成鹽復合物沉淀法 七． 熱變性及酸堿變性沉淀法 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 一、等電點沉淀法 原理： 利用兩性電解質(zhì)在電中性時溶解度最低； 優(yōu)點： 許多蛋白的等電點都在偏酸范圍內(nèi)，而許多無機酸的價格低廉，并能為食品標準允許； 缺點： 酸化時易引起蛋白失活。發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工系 第十三章 發(fā)酵產(chǎn)物分離原理與技術(shù) 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 發(fā)酵產(chǎn)物分離原理與技術(shù) 第一節(jié) 沉淀分離法 第二節(jié) 吸附和樹脂分離法 第三節(jié) 離子交換法和離子交換膜電滲析分離法 第四節(jié) 萃取與浸取分離法 第五節(jié) 膜分離技術(shù) 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 第一節(jié) 沉淀分離法 ? 沉淀是物理環(huán)境的變化引起溶質(zhì)的溶解度降低，生成固體凝聚物的現(xiàn)象。 ? 沉淀法 方法簡單、成本低、使用廣泛 ，一般作為初步分離的手段。 不少蛋白質(zhì)與金屬結(jié)合后會發(fā)生等電點偏移，如胰島素的等電點為 ，在與 Zn2+結(jié)合形成胰島素鋅鹽，其等電點升為 ；故加入金屬離子后選擇等電點沉淀時，要注意調(diào)整 pH。工業(yè)生產(chǎn)胰島素 (pI＝ )時，先調(diào) pH至，再調(diào) pH至 (同時加入一定濃度的有機溶劑以提高沉淀效果 )。用 mol/L TrisHCl緩沖液重新溶解，加入 20～ 40%飽和度的硫酸銨分級，離心收集的沉淀 TrisHCl緩沖液再次沉淀，即得較純的堿性磷酸酯酶。 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 二、鹽析法 ? 蛋白質(zhì)在高離子強度的溶液中溶解度降低，發(fā)生沉淀的現(xiàn)象稱為 鹽析 。 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 鹽析原理示意圖 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 鹽析原理 圖 1 碳氧血紅蛋白的溶解度與硫酸銨離子強度的關(guān)系圖 蛋白質(zhì)的溶解度與鹽濃度間的關(guān)系可用 Cohn方程式表示： logS/S0 = － Ks S0 — 純?nèi)軇?I = 0）時蛋白的溶解度； Ks — 鹽析常數(shù)，與溫度和 pH無關(guān)； I — 離子強度 當溫度一定時， S0對于某一溶質(zhì)是一常數(shù)，即logS0 = ? ?是溶質(zhì)的特征常數(shù)，對于蛋白質(zhì)而言，其大小主要取決于不同蛋白質(zhì)的性質(zhì)，它也與溶液的溫度和 pH值有關(guān)，但與鹽的種類無關(guān)。 1）蛋白質(zhì)濃度 ? 高濃度的蛋白溶液，可減少鹽的用量；但共沉現(xiàn)象嚴重 ?用低濃度蛋白溶液進行鹽析，需用較多的鹽，共沉作用較輕 2）離子強度和種類 3）溫度 ? 溫度是影響溶質(zhì)溶解度的重要因素，升高溫度可以增加許多無機鹽和小分子有機化合物的溶解度； ? 但在高鹽濃度中，蛋白質(zhì)等生物大分子物質(zhì)的溶解度隨溫度的升高反而減小 這主要是因為蛋白質(zhì)分子在水化時要吸熱，失水時則放熱；溫度升高有利于蛋白質(zhì)失水沉淀。 (▼ )KCl。(? )（ NH4)2SO4。(□ )K2SO4。這種沉淀作用是 多種效應(yīng)的結(jié)果 ，但 主要作用 是 降低水溶液的介電常數(shù) 。 ? 對于具有表面水層的生物分子，有機溶劑與水的作用，使這些分子表面水層厚度不斷壓縮，最后使這些分子脫水而相互聚集析出。 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 蛋白質(zhì)分子表面 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 ? 用于生物物質(zhì)沉淀的有機溶劑須能與水互溶，但對蛋白無作用； ? 例如：乙醇、甲醇、丙酮、二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、氯仿、乙醚等； ? 乙醇是核酸、糖類、氨基酸和核苷酸等物質(zhì)最常用的沉淀劑； ? 在沉淀過程中，乙醇與水混合時放出大量的稀釋熱，使溶液的溫度顯著升高，這對熱穩(wěn)定性較差的產(chǎn)物影響較大（少量多次、攪拌） 1）有機溶劑的種類 2）溫度 多數(shù)生物物質(zhì)在有機溶劑與水的混合液中的溶解度是隨溫度的降低而降低的，因此降低溫度可增加收率；低溫沉淀還能更好地保護生物物質(zhì)的活性 3） pH ? 在結(jié)構(gòu)穩(wěn)定范圍內(nèi)，選擇溶解度最低時的 pH，有助于提高沉淀效果；在接近等電點處，引起沉淀所需有機溶劑的量最??； ? 合適的 pH還可大大提高分離的分辨能力 4）樣品濃度和分子質(zhì)量 ? 低濃度樣品需要使用有機溶劑的量較大，但共沉作用小，有利于提高分離的效果；但低濃度樣品損失較大，回收率低； ? 高濃度樣品使用有機溶劑的量較小，減少了變性的危險；但共沉作用大，分離效果較差。 5）金屬離子和離子強度 ? Mn 2+、 Fe 2+、 Co 2+、 Cu 2+、 Zn 2+ 等離子能與蛋白質(zhì)的羧基、氨基和含有氮雜環(huán)的化合物結(jié)合； ? Ca 2+、 Ba 2+、 Mg 2+、 Pb 2+能與羧基結(jié)合； ? Ag +、 Hg 2+、 Pb 2+ 能與巰基結(jié)合形成復合物； ?某些有機化合物能與生物大分子形成難溶復合物 . 這類復合物在水或有機溶劑中的溶解度都大大降低，而不影響蛋白質(zhì)的生物活性，同時還能降低有機溶劑的用量。 缺點： 易引起蛋白變性；易燃、易爆 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 有機溶劑沉淀法的注意事項 （ 1）降低溫度，能增加收率和減少蛋白質(zhì)的變性。 （ 3）蛋白質(zhì)的分子量越大，產(chǎn)生沉淀所需加入的有機溶劑量越少。 （ 5）沉淀的蛋白質(zhì)如不能再溶解，就可能已經(jīng)變性。 （ 7）接近等電點時，引起沉淀所需加入有機溶劑的量較少。 （ 9）少量中性鹽的存在能產(chǎn)生鹽溶作用，增加蛋白質(zhì)在有機溶劑水溶液的溶解度。 ? 機制： 可能降低生物大分子水化度，與大分子發(fā)生共沉作用；與生物大分子形成復合物；或通過空間位置排斥，使液體中的微粒被迫聚集而沉淀。 ? 吸附劑 ：吸附操作使用的固體，一般為多孔微粒，具有很大的比表面積，這類物質(zhì)就是吸附劑。 ? 缺點 ： 選擇性差、收率不太高、特別是無機吸附劑性能不穩(wěn)定，不能連續(xù)操作，勞動強度大，有些不環(huán)保。 ? 吸附作用是一組分子引力的總稱： 定向力、誘導力和色散力 。 ? 吸附的分類 ? 影響吸附的因素 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 吸附的分類 a. 物理吸附 吸附劑和吸附物通過分子力 (范德華力 )產(chǎn)生的吸附。 c. 交換吸附 吸附劑表面如為極性分子或離子所組成則它會吸引溶液中帶相反電荷的離子而形成雙電層。 發(fā)酵工程 Fermentation Engineering 李先磊 化學化工學院 影響吸附的因素 a. 吸附劑的性質(zhì) ：吸附劑的理化性質(zhì)對吸附的影響很大； b. 吸附物的性質(zhì) ； c. 溶液的 pH值 ：影響化合物的解離程度； d. 吸附過程的溫度 ：吸附熱越大，溫度影響越大； e. 其他組分的影響 ：含有兩種或以上的組分的溶液，其他組分會影響吸附效果。 發(fā)酵工程 F