【正文】 啶二聚體 非聚合狀態(tài) (正常 DNA) ?切除修復(fù) ?細(xì)胞內(nèi)最重要和有效的修復(fù)方式 ?堿基切除修復(fù) /核苷酸切除修復(fù) /錯(cuò)配修復(fù) ?重組修復(fù) ?復(fù)制后修復(fù) ?E .coli DNA重組修復(fù)的酶 Rec A和 Rec BCD ?DNA傾向差錯(cuò)合成 ?誘導(dǎo)產(chǎn)生缺乏校對(duì)功能的 DNA聚合酶（ Ⅳ 、 Ⅴ) ?在 DNA損傷部位進(jìn)行復(fù)制而避免了死亡 ?SOS修復(fù) ?DNA損傷廣泛、緊急狀況下整體動(dòng)員而誘發(fā)的反應(yīng) ?SOS修復(fù)系統(tǒng) = 切除修復(fù) +重組修復(fù) +調(diào)控蛋白 = Uvr（ uvr） +Rec（ rec） +LexA ?切除修復(fù) 堿基切除 修復(fù) 核苷酸 切除修復(fù) 錯(cuò)配修復(fù) ?切開 識(shí)別、切除損傷部位磷酸二酯鍵 DNA糖苷酶 UvrA、UvrB MutH/MutS /MutL ?清除 清除損傷 DNA 核酸內(nèi)切酶 UvrC DNA解旋酶 II /SSB/ 核酸外切酶 I ?合成 DNA聚合酶合成 DNA聚合酶Ⅰ (DNAPⅠ ) DNA聚合酶Ⅰ DNA聚合酶III ?連接 DNA連接酶連接 DNA連接酶 DNA連接酶 DNA連接酶 （三）逆轉(zhuǎn)錄 反 轉(zhuǎn)錄和 反 轉(zhuǎn)錄酶 ?逆轉(zhuǎn)錄的概念 （ RNA DNA） RNA為模板 逆轉(zhuǎn)錄酶 4種 dNTP 堿基配對(duì)的原則 cDNA （互補(bǔ) DNA不含內(nèi)含子，只含外顯子） ?逆轉(zhuǎn)錄酶 (RNA依賴的 DNA聚合酶 ) ?有三種活性： ?RNA為模板的 DNA聚合酶 ?RNAase ?DNA為模板的 DNA聚合酶 ?逆轉(zhuǎn)錄過程 ?催化三種反應(yīng)： ?RNA指導(dǎo)的 DNA合成 ?RNA水解 ?DNA指導(dǎo)的 DNA合成 ?逆轉(zhuǎn)錄的意義 ?RNA同樣兼有遺傳信息傳代與表達(dá)功能 ?逆轉(zhuǎn)錄病毒（ RNA病毒） ?癌基因： 白血病病毒 ?其他： 艾滋病病毒（ HIV） /雞禽流感病毒 /SARS ?基因工程獲得目的基因的重要方法之一 七、 RNA的生物合成 ?復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的區(qū)別 A U ， T A ， G CA T ， G C配對(duì)mRNA ， tRNA ， rR NA子代雙鏈 DNA（ 半保留復(fù)制）產(chǎn)物RNA 聚合酶（ RNA pol ）DNA 聚合酶酶NTPdNT P原料模板鏈轉(zhuǎn)錄（不對(duì)稱轉(zhuǎn)錄）兩股鏈均復(fù)制模板轉(zhuǎn)錄復(fù)制， ， ，（）酶引物 需要 RNA引物 不需要引物 ? 復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的相同點(diǎn) ?模板 ?DNA ?原料 ?核苷三磷酸 ?堿基配對(duì) ?堿基配對(duì)原則 ?聚合酶 ?依賴 DNA的聚合酶 ?合成方向 ?5’ 3’ ?產(chǎn)物 ?多核苷酸 ?RNA轉(zhuǎn)錄的基本過程 原核生物 真核生物 ?起始 ? RNA聚合酶 結(jié)合在轉(zhuǎn)錄模板的 起始區(qū)域 。 ? RNA引物 DNA聚合酶 ? 不能 催化兩個(gè)游離的dNTP在 DNA模板上聚合 ? 需要具 3’ OH的引物 RNA聚合酶 ? 能 催化兩個(gè)游離的 NTP在 DNA模板上聚合 ? 提供 3’ OH ? 引物最后要被 DNA聚合酶 Ⅰ 除去，缺口由該酶補(bǔ)滿，再由連接酶連接 減少突變，提高 DNA復(fù)制的真實(shí)性 （ 1）原核生物 DNA復(fù)制的基本過程 ?原核生物的 DNA復(fù)制過程 ?復(fù)制的起始 雙向復(fù)制（ θ 型復(fù)制） ?特定起始點(diǎn) ?解鏈 /解旋 /穩(wěn)定單鏈 ?引發(fā)體和引物 ?oriC ?DnaA、 B、 C/拓?fù)洚悩?gòu)酶 /SSB ?引發(fā)體 =DnaB+DnaC+DnaG(引物酶 ) ?引物 :RNA提供 3’OH ?復(fù)制的延長(zhǎng) ?子鏈的延長(zhǎng) ?子鏈延長(zhǎng)方向 ?領(lǐng)頭鏈 ?隨從鏈 ?DNA聚合酶 Ⅲ/dNTP/3 ’,5’磷酸二酯鍵 ?5’ 3’ ?模板： 3’ 5’，子鏈： 5’ 3’ ?模板： 5’ 3’，子鏈： 5’ 3’， 崗崎片段 3’ 5’ 5’ 3’ ?復(fù)制的終止 ?去除 RNA引物 ?補(bǔ)充空缺 ?連接 ?DNA聚合酶 Ⅰ 的小片段 5’ 3’ 外切酶 ?DNA聚合酶 Ⅰ 的大片段 3’ 5’ 外切酶 5’ 3’ 聚合酶 ?DNA連接酶 ? 參與原核生物 DNA復(fù)制的酶 ?參與 DNA復(fù)制的酶 ?DNA聚合酶 ?解螺旋酶 ?引物酶 ?單鏈 DNA結(jié)合蛋白 (SSB） ?拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅰ/Ⅱ ?DNA連接酶 ?DNA聚合酶 Ⅰ ? 多功能酶 5’ 3’ 外切酶 3’ 5’ 外切酶 5’ 3’ 聚合酶 ? 單鏈多肽 大小二個(gè)片段 ? 切除 RNA引物， 填補(bǔ)空缺 ? 損傷后修復(fù) ?DNA聚合酶 Ⅱ 與 Ⅲ ? 多功能酶 5’ 3’ 聚合酶 3’ 5’ 外切酶 ? 不對(duì)稱二聚體 單體 1前導(dǎo)鏈 /單體 2隨從鏈 ? DNA 復(fù)制的主要酶 高續(xù)進(jìn)性 高聚合酶活性 高產(chǎn)物真實(shí)性 ?DNA聚合酶 3’ 5’ 5’ 3’ 外切酶 聚合酶 N C 5’ 3’ 外切酶 小片段 大片段（ klenow片段） 切除 RNA引物 損傷修復(fù) 校讀功能 （ 常用的工具酶） ? DNA聚合酶 Ⅰ 聚合功能 ?切口平移技術(shù)標(biāo)記 DNA片段 5’ 3’ 外切酶 5’ 3’ 聚合酶 3’ 5’ 外切酶 ? 解螺旋酶、引物酶、單鏈 DNA結(jié)合蛋白、 拓?fù)洚悩?gòu)酶 蛋白質(zhì)（基因） 通用名 功能 引 發(fā) 體 DnaA（ dnaA） DnaB（ dnaB） DnaC（ dnaC） 解螺旋酶 辨認(rèn)起始點(diǎn) 解開 DNA雙鏈 運(yùn)送和協(xié)同 DnaB DnaG（ dnaG） 引物酶 催化 RNA引物生成 SSB 單鏈 DNA結(jié)合蛋白 穩(wěn)定已解開的單鏈 拓?fù)洚悩?gòu)酶 理順 DNA鏈 ? 質(zhì)粒的不相容性 /反義 RNA ?質(zhì)粒的不相容性 ?細(xì)菌內(nèi)的質(zhì)粒排斥同一類型質(zhì)粒進(jìn)入 同一細(xì)胞 ?舉例： E .coli 質(zhì)粒 ColE1的 DNA復(fù)制 ?引物 RNA前體 （一定構(gòu)象） RNAaseH 引物 RNA ?RNA1質(zhì)粒 DNA另一條鏈的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 + 與引物前體互補(bǔ)，改變前體構(gòu)象 RNAaseH（ ） 引物無法產(chǎn)生 ? RNA1與質(zhì)粒 DNA數(shù)成正比 ? RNA1是一種反義 RNA 反義 RNA 能夠 互補(bǔ)和雜交 于一個(gè)基因特異的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（ 復(fù)制引物 /mRNA)， 抑制 其功能的 RNA ? DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 ?拓?fù)洚悩?gòu)酶 ?水解 3’, 5’磷酸二酯鍵 ?連接 3’, 5’磷酸二酯鍵 ?切斷、整理 DNA雙鏈，負(fù)超螺旋 松弛型 ?Ⅰ 型 ?top Ⅰ ? 作用于負(fù)超螺旋 ? 切斷 DNA雙螺旋中的 一股 ， 張力下降后封閉。1 一、蛋白質(zhì)化學(xué) （一）氨基酸 ?蛋白質(zhì)的氨基酸組成 ?編碼氨基酸： 20種 /受遺傳密碼控制 ?非編碼氨基酸：翻譯后加工 ?編碼氨基酸結(jié)構(gòu)特點(diǎn) ?構(gòu)件分子： L,α 氨基酸 ?除 Gly外，其余都是 L,α 氨基酸 ?Pro為亞氨基酸 ?R基團(tuán)的不同是分類的基礎(chǔ) ?編碼氨基酸分類 ?酸性氨基酸 ?堿性氨基酸 ?中性氨基酸 2 咪唑基 胍基 吡咯環(huán) 結(jié)構(gòu)特點(diǎn)： : phe : Tyr : Trp :Ser Thr : Cys Met :Arg : His 3 (二 ) 氨基酸的理化性質(zhì) ?兩性電離 ?等電點(diǎn) (pI） ?在水溶液中能兩性電離而成兼性離子 ?分子呈電中性時(shí)的溶液的 pH值 ?紫外吸收 ?芳香族氨基酸特有 (phe， Tyr,Trp) ?吸收峰：波長(zhǎng) 280nm ?茚三酮反應(yīng) 加熱 ?氨基酸 + 茚三酮 藍(lán)紫色化合物 (570nm) ?Pro + 茚三酮 黃色化合物 ?氨基酸的定量方法 4 （三）蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次 ?一級(jí)結(jié)構(gòu) ?從 N端到 C端氨基酸（殘基）排列順序 ?是蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu) ?是空間結(jié)構(gòu)、生理功能的基礎(chǔ) ?維系鍵肽鍵 / 二硫鍵 ?二級(jí)結(jié)構(gòu) ?肽鏈主鏈骨架原子局部空間結(jié)構(gòu) ?α 螺旋 /β 折疊 /β 轉(zhuǎn)角 /無規(guī)卷曲 /模體 ?維系鍵氫鍵 ?三級(jí)結(jié)構(gòu) ?肽鏈主鏈、側(cè)鏈骨架原子局部空間結(jié)構(gòu) （結(jié)構(gòu)域 /分子伴侶） ?球狀或橢圓狀蛋白質(zhì) ?親水表面和疏水內(nèi)核 ?大部分蛋白質(zhì)到三級(jí)結(jié)構(gòu)已有生物活性 ?例如：肌紅蛋白 、免疫球蛋白 ?維系鍵疏水鍵 ?四級(jí)結(jié)構(gòu) ?蛋白質(zhì)分子中各個(gè) 亞基 的空間排布 ?舉例：血紅蛋白（ α 2β 2） ?維系鍵離子鍵 5 ?模體（ motif） ?蛋白質(zhì)分子中 2～ 3個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)肽段，在空間上有規(guī)律地聚集起來，形成相對(duì)穩(wěn)定、特殊的空間構(gòu)象 ?具有特殊的生理功能 ?例如： α 環(huán) α —— 鈣結(jié)合蛋白 βαβ —— 鋅指 ?結(jié)構(gòu)域 ?分子量大的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)可分割成 1個(gè)和數(shù)個(gè) 球狀或纖維狀的區(qū)域 ?具有功能 ?例如：酶的活性中心 6 ?分子伴侶 ?空間構(gòu)象的決定因素之一 (一級(jí)結(jié)構(gòu) /分子伴侶 ) ?本質(zhì)是蛋白質(zhì) (熱休克蛋白 Hsp70/異構(gòu)酶 ) ?提供一個(gè)保護(hù)環(huán)境 ?加速蛋白質(zhì)折疊成天然構(gòu)象或四級(jí)結(jié)構(gòu) ?亞基 ?在蛋白質(zhì)的 四級(jí)結(jié)構(gòu) 中，每個(gè)各 具獨(dú)立三級(jí)結(jié) 構(gòu) 的多肽鏈稱為亞基 ?亞基單獨(dú)存在不具有生物活性 7 ?一級(jí)結(jié)構(gòu)是決定三維結(jié)構(gòu) 和生物學(xué)活性的基礎(chǔ) ?牛核糖核酸酶 的變性和復(fù)性實(shí)驗(yàn) ?比較幾種氨基酸順序相似的 蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性 ?蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的范例 ?肌紅蛋白 :三級(jí)結(jié)構(gòu) ?血紅蛋白 :四級(jí)結(jié)構(gòu) (別構(gòu)效應(yīng) /氧解離曲線呈 S形 ) ?蛋白質(zhì)折疊 需要分子伴侶 /伴侶蛋白 ?天然非折疊蛋白質(zhì) (內(nèi)在非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì) ) ?天然蛋白質(zhì) ,沒有完全折疊成特定 三級(jí)結(jié)構(gòu) ,但具備功能 ?與其他蛋白質(zhì)相互作用 ,具有功能 多樣性 8 （四）蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) ?蛋白質(zhì)的兩性電離 ?大多數(shù)人體蛋白質(zhì) pI= ?在 陰離子 ?蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì) ?水化層 ?電荷層 ?蛋白質(zhì)變性和復(fù)性 ?變性 :空間結(jié)構(gòu)破壞 ,一級(jí)結(jié)構(gòu)不變 , 生物學(xué)活性喪失 ?蛋白質(zhì)紫外吸收 ?λ=280 nm 有特征性吸收峰 ?蛋白質(zhì)定性、定量方法 9 ?蛋白質(zhì)的變性 ?變性因素 ?物理或化學(xué)因素 ?機(jī)制 ?蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞 ?一級(jí)結(jié)構(gòu)未破壞 ?性質(zhì)的變化 ?溶解度降低 /黏度增加 ?結(jié)晶能力消失 /生物活性喪失 ?易被蛋白酶水解 ?實(shí)際應(yīng)用 ?防止蛋白制劑 /蛋白質(zhì)藥物的變性失活 ?使細(xì)菌蛋白質(zhì)變性失活，消毒殺菌 10 （五）蛋白質(zhì)的分離和純化 ?根據(jù)分子大小 的純化方法 ?透析和超濾 ?超速離心 ?凝膠層析 ?利用大分子蛋白質(zhì)性質(zhì) ?密度、形態(tài)、沉降系數(shù)不同 ?利用溶解度 差別的純化 方法 ?等電點(diǎn)沉淀 ?鹽析 ?丙酮沉淀 ?利用蛋白質(zhì)等電點(diǎn)不同 ?破壞水化層 /電荷層 11 ?根據(jù)電荷不同 的純化方法 ?電泳 ?SDSPAGE ?IEF ?雙向電泳 ?（ SDSPAGE/IEF） ?毛細(xì)管電泳 ?蛋白質(zhì)兩性電離性質(zhì) ?離子交換層析 ?利用對(duì)配體的生物親和力的純化方法 ?親和層析 ?配體 — 抗體 /酶的底物 ※ HPLC （離子交換 /親和層析 /凝膠層