【正文】 的持續(xù)分裂，端粒會緩慢縮短 . 端粒的功能 ? 能封閉正常染色體末端，維持了染色體結構的完整性。 ? 端粒 DNA的平均長度因物種而異。 ? 大多數(shù)有機體的端粒 DNA由非常短的串聯(lián)重復 DNA排列而成，富含鳥嘌呤。 ? 病毒基因組織有重疊基因的存在。 ? 病毒核酸存在形式多樣 如單鏈 RNA，雙鏈RNA，單鏈 DNA，雙鏈 DNA；線狀和環(huán)狀兩種。 ?紅色為正義 RNA段 ?藍色為反義 RNA段 ?綠色為目標信使RNA； ? dsRNA觸發(fā)了高效的基因沉默機制并極大降低了靶mRNA水平，達到干擾目的 RNAi的效應 ? siRNA與靶 mRNA形成的雙鏈結構 ?阻止其它蛋白因子與靶 mRNA的結合； ?影響靶 mRNA其它區(qū)域的空間結構的形成； ?形成的雙鏈結構體區(qū)會成為雙鏈 RNA酶的作用靶標，使靶 mRNA被降解。 RNAi 的機制 ? 第二步（效應階段） ?siRNA 在 ATP參與下被 RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導形成 RNA誘導的沉默復合體（ RISC）由 siRNA、解旋酶、 ATP、核酸內(nèi)切酶、核酸外切酶等多種成分組成。即一種 RNA能夠有效地控制另一種 RNA的活性。 ?特點 與靶基因結合能力強，穩(wěn)定性好，易吸收，在體內(nèi)具有內(nèi)切酶活性和抑制端粒作用。 ?反義 DNA ?反義 RNA ?肽核酸 肽核酸 (peptide nucleic acid, PNA) ? 是指在特定肽鏈上連接不同堿基的核酸。反應體系中含有標記的 dNTP,隨機摻入新合成的 DNA鏈中，探針即被標記。 ? 被標記的 DNA（探針）變性成單鏈，引物與模板結合。 隨機引物法（ 6核苷酸引物標記法） ? 原理及過程 ： ?利用 DNA聚合酶 I的 Klenow亞單位 ，合成含有標記核苷酸的 DNA鏈。隨著反應的進行底物中被標記的單核苷酸，隨機摻入。多數(shù)探針的制備都通過分子克隆的方法獲得。 ? 寡核苷酸探針 ?根據(jù)已知基因序列，人工合成一段互補的 DNA片段。 ? 常用的標記方法 ?缺口平移法 ?隨機引物法 探針來源 ? 基因組探針 ?從已建立的基因組文庫中篩選和分離所需的目的基因。 探針的標記 將探針標記上一種標識物以便雜交后檢測。 雙鏈 probe或 DNA解鏈主要取決于： 1． 鏈的長度 ：鏈越長，需要的 能量多才能解鏈； 2． 堿基成分 ： GC含量高，較難變性； 3． 化學環(huán)境 ：單價陽離子穩(wěn)定雙鏈，甲酰胺，尿素破壞雙鏈 核酸探針 ? 核酸探針 是指帶有標記的某一特定 DNA或 RNA片斷，能與待測樣本中單鏈核酸分子互補配對結合，進而檢測同源序列。 ? DNA分子的變性是一個爆發(fā)過程，變性作用發(fā)生在一個很狹窄的溫度范圍（ 6～ 8℃ ），變性曲線為雙曲線 核酸的復性 ? 定義 指變性 DNA分子在適當條件下，兩條彼此分開的鏈自發(fā)重新締合成為雙螺旋結構 ? 復性過程 ：成核作用；拉拉鏈作用 ? 復性條件 ?足夠的鹽濃度， ～ ?合適的溫度：比 Tm低 20～ 25℃ ?樣品的性質(zhì) ?DNA的濃度 ?DNA片段的大小 核酸雜交技術（分子雜交） ? 分子雜交技術 利用核酸雙鏈的堿基互補、變性和復性的原理，可以用已知堿基序列的單鏈核酸片段作為探針，與待測樣本中的單鏈核酸互補配對，以判斷有無互補的同源核酸序列的存在。 核酶的催化活性 ? 核苷酸轉(zhuǎn)移作用 ? 磷酸二酯鍵水解作用 ? 磷酸轉(zhuǎn)移反應催化作用 ? 脫磷酸作用 ? 限制性內(nèi)切酶作用 核酸的雜交 ? 定義 ?不同來源的、 序列互補的單鏈 RNA、 DNA，或 DNA和 RNA，根據(jù)堿基互補原則，借助氫鍵連接為雙鏈分子的過程。 核酶的類型 ? 剪切型核酶 ?催化自身或者異體 RNA的切割，相當于 核酸內(nèi)切酶 。 核酶發(fā)現(xiàn)的意義 ? 它突破了“酶是蛋白質(zhì)”的傳統(tǒng)概念。 ? 副密碼子： tRNA分子上決定其攜帶何種氨基酸的區(qū)域，能被 AAtRNA合成酶識別。 tRNA tRNA的二級結構 ? aa接受臂（ amino acid arm） ? 二氫尿嘧啶環(huán) （ DHU loop） ? 反密碼環(huán)（ anticodon loop） ? 額外環(huán)（ extra loop） ? TψC環(huán)（ TψC loop） ? 同功 tRNA：識別同種氨基酸，但反密碼子不同的多個 tRNA。 真核生物 mRNA的結構 ? 3?端具有 polyA結構； ? 5?端具有帽子結構； ? 只有一個開放閱讀框。 變性 ? 核內(nèi)不均一 RNA（ hnRNA） ?真核細胞 mRNA的原始轉(zhuǎn)錄物是分子量極大的前體，在核內(nèi)加工過程中所形成的分子大小不一的中間產(chǎn)物。雙螺旋 DNA的松開導致負超螺旋，而擰緊則導致正超螺旋。 ? 大溝和小溝是 DNA行使功能時蛋白質(zhì)的識別位點，構象發(fā)生變化，蛋白質(zhì)對 DNA分子的識別也發(fā)生相應變化 核酸分子中的回文序列 回文序列中的單鏈可形成發(fā)卡結構 雙鏈回文序列可形成十字架結構 DNA超螺旋結構 ? 超螺旋的意義 ：緊密，體積更??；能影響雙螺旋的解鏈程序，因而影響 DNA分子與其它分子之間的相互作用。 ?必須穩(wěn)定地含有關于有機體細胞結構、功能、發(fā)育和繁殖的各種信息 ?必須能精確的復制，使后代具有與親代細胞相同的信息 ?必須能夠變異，為生物的進化提供基礎 遺傳物質(zhì)的基本特點 ? 生物的遺傳物質(zhì)是 DNA ? Griffith， 1928：肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗 ? Avery， 1943：體外轉(zhuǎn)化實驗 ? Hershey， 1952：噬菌體轉(zhuǎn)導實驗 ? DNA雙螺旋模型 1953 Watson/Crick 提出了 DNA雙螺旋結構模型； 意義：對生命科學的發(fā)展作用可與達爾文學說媲美，與孟德爾定律齊名。從而使遺傳學的研究全面進入分子遺傳學階段． ? 確定了遺傳信息的傳遞方式 ?1961 年 Monod 和 Jacob 提出了操縱子學說； ?1964 年 Nirenberg 等提出了“三聯(lián)體密碼說”； ?Crick 提出了遺傳信息流向和表達的 中心法則 ? 這三大發(fā)現(xiàn)大大促進了生命科學的迅速發(fā)展，為基因工程的誕生奠定了重要的理論基礎． ? 右手螺旋： ADNA、 BDNA、 CDNA、 DDNA ? 左手螺旋： ZDNA ? 螺旋盤繞的松散程度受 DNA分子的內(nèi)力影響， DNA雙螺旋結構永遠處于動態(tài)平衡中，條件變化， BDNA構象變化，可以形成 ADNA或 CDNA等。 ? 包括 正超螺旋 和 負超螺旋 ，在一定條件下，可互相轉(zhuǎn)變。 超螺旋 DNA的性質(zhì) ? 結構緊密，粘度較低，浮力密度大，沉降速度快。 ? 開放閱讀框（ open reading frame， ORF） ?mRNA分子上從起始密碼子開始到終止密碼子結束的一段連續(xù)的核苷酸序列，即 mRNA分子上的編碼區(qū)。 原核生物 mRNA的結構 ? 3?端不具有 polyA結構； ? 具有一個或多個開放閱讀框。 ? 多數(shù) tRNA和少數(shù) tRNA：反密碼子相同但結構不同的 tRNA。 核酶（ ribozyme） ? 核酶 (Ribozyme)是一種具有核酸內(nèi)切酶活性的 反義 RNA分子 ，可特異性地切割靶 RNA序列，具有解離后重復切割相同靶分子的能力。 ? 核酸性酶的發(fā)現(xiàn)對科學家們普遍感興趣的 生命的起源 這一問題有了新的認識，對生物前化學（ prebiotic chemistry）有重要貢獻。 ? 剪接型核酶 ?具有 核酸內(nèi)切酶和連接酶兩種活性 。 ? 核酸雜交類型 ?單鏈 DNA與單鏈 DNA雜交（ DNADNA） ?單鏈 DNA與單鏈 RNA雜交（ DNARNA） ?單鏈 RNA與單鏈 RNA雜交（ RNARNA） 核酸的變性 ? 定義 ：指核酸雙螺旋區(qū)的氫鍵斷裂，變成單鏈，但并不涉及共價鍵的斷裂 ? 變性方法 ：熱變性、酸堿變性、化學變性劑 ? 增色效應（ hyperchromicity） 由于 DNA變性而引起的光吸收增加的現(xiàn)象 ? DNA的融點（或熔解溫度， Tm） DNA分子的一半發(fā)生變性時的溫度為 Tm。 ? 分子雜交的目的 就是運用特異性探針鑒定復雜的靶 DNA中同源的 DNA片段。 ? Probe可以是整個基因，或是基因的一部分，是 DNA，也可以是 RNA。 ? 常用于標記探針的標識物 ?同位素 ： 32P , 35S , 3HdNTP等； ?非同位素 ：地高辛 dNTP ，生物素 dNTP。 ? DNA克隆 ? cDNA探針 ?從已構建的 cDNA文庫中篩查和分離目的基因探針。一般長約 15～ 50個 bp。 缺口平移法 （ Nick Translation） ? 反應體系中 DNA酶 I隨機在探針 DNA上打開缺口，然后利用 DNA聚合酶 I 5’ → 3’ 外切酶活性，在缺口處按 5’→ 3’ 方向切除單核苷酸；同時DNA聚合酶 I有 5’ → 3’ 的聚合酶活性，在缺口處 3’ 端加入底物中的單核苷酸，彌補缺口處的核苷酸鏈。 DNA聚合酶 I的兩種作用交替進行，探針即被標記。 Klenow具有 5’→ 3’聚合酶活性。在 Klenow的催化下，以引物 3’ 端為起點，沿模板 3’ → 5’ 方向合成 DNA新鏈。 常用核酸分子雜交方法 ? Southern 印跡雜交法 ? Northern 印跡雜交法 ? 斑點雜交或狹縫雜交法 ? 菌落雜交 ? 夾心雜交法 ? 原位雜交 三種印跡技術的比較 核酸分子雜交（固相雜交）操作程序 制備待測核酸樣品 分離、變性、轉(zhuǎn)移、固化 DNA片段 雜交 加入標記核酸探針 檢測雜交信號 標記核酸探針 預雜交 制備核酸探針 漂洗去除未參與雜交的標記探針 基因芯片 ? 基因芯片 是在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接將大量 DNA探針以點涂的方式有序地固化于支持物表面，然后與標記的樣品雜交，通過對雜交信號的檢測分析，即可得出樣品的信號（即基因序列或表達的信息） ? 突出特點 ：高度并行性、多樣性、微型化、自動化 反義核酸 ? 反義核酸 （ antisense nuleic acid）是根據(jù)堿基互補原理，用人工合成或生物體自身合成的 特定互補的 DNA或 RNA片段 （或其化學修飾的衍生物），能夠與目的序列結合，通過 空間位阻效應或誘導 RNase活性 ，在復制、轉(zhuǎn)錄、剪接、mRNA轉(zhuǎn)運及翻譯等水平， 抑制或封閉目的基因的表達 反義技術（ antisense technology） ? 根據(jù)堿基互補原理，用人工合成或生物體自身合成的特定互補的 DNA或 RNA片段（或其化學修飾產(chǎn)物）抑制或封閉目的基因的表達的技術。即：以類氨基多肽鏈（ N氨基乙烷基乙酸鏈）代替核酸中的磷酸戊糖骨架，并按一定序列結合上標準的 A、 G、 C、 T堿基 . ? 第三代反義寡核苷酸藥物 ?作用 肽核酸可與互補 DNA或 RNA特異性結合，抑制或封閉基因表達。 反義核酸的有效抑制結合區(qū) ? mRNA5?端非翻譯區(qū) ? mRNA5?端編碼區(qū)，主要是起始密碼 AUG ? mRNA5?端帽子形成位點 ? 前體 mRNA外顯子和內(nèi)含子結合部位 ? mRNApolyA形成位點 ? 阻止 mRNA的成熟和向胞漿的轉(zhuǎn)運 RNA干擾 ? RNAi：一條短小的單鏈 RNA與一條 mRNA的互補區(qū)發(fā)生堿基配對作用，從而阻遏這條mRNA的表達。 ? 具有 RNA干擾作用的 RNA分子稱為 小干擾RNA（ small interfering RNA， siRNA） . RNAi 的機制 ? 第一步（起始階段） ?較長 ds RNA在 ATP參與下被 RNaseⅢ 樣的特異核酸酶 (Dicer)切割加工成 21~23nt的由正義和反義鏈組成的小干擾 RNA。 ?活化的 RISC在 單鏈 siRNA引導下識別互補的mRNA，并在 RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNA引導鏈中心所對應的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶進一步降解，從而干擾基因表達。 RNAi 的特點 ? 轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默 ?指轉(zhuǎn)基因能夠在細胞核里被穩(wěn)定地轉(zhuǎn)錄，但在細胞質(zhì)里卻無相應的 mRNA 存在這一現(xiàn)象 ? 較高的特