【正文】 Ampr基因編碼 ?內(nèi)酰胺酶，特異地切割氨芐青霉素的 ?內(nèi)酰胺環(huán)。 理想載體條件 A、 較小的分子和較高的拷貝數(shù) B、 多個單一的限制性內(nèi)切酶位點 C、 兩種以上的選擇標記 D、 易導入宿主細胞并復制和表達 ： 氨芐青霉素抗性（ Ampr） 卡那霉素抗性 （ Kanr） 四環(huán)素抗性 （ Tetr） 鏈霉素抗性 （ Strr） 氯霉素抗性 （ Cmlr） 絕大多數(shù)質(zhì)粒載體都是用抗菌素抗性標記： i）氨芐青霉素（ Ampicillin， Amp） ,青霉素的衍生物。但細菌群體容易自發(fā)突變出抗 colicin E1的細胞 colicin E1能殺死不含 ColE1 質(zhì)粒的菌，形成“噬菌斑”。 （ 2）篩選標記不理想 ColE1質(zhì)粒的篩選標志是大腸桿菌素 E1（ colicin E1）。 pSC101 kb 拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標記基因 Tcr ColE1 kb 拷貝數(shù) 20 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標記基因 E1 RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標記基因 Apr 天然質(zhì)粒的缺陷 （ 1）分子量大，拷貝數(shù)低 第一個用于基因克隆的天然質(zhì)粒pSC101，分子長 kb。 質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性 革蘭氏陰性菌的質(zhì)粒可分成兩大類： 接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞，如 F、 Col、 R質(zhì)粒等 非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用如 Col、 R的其它成員 某些非接合型質(zhì)粒（ ColE1） 在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生 DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由 bom 和 mob 基因決定。 開環(huán) DNA（ open circular， ocDNA） 同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同： scDNA最快、 L DNA次之、 ocDNA最慢。第三章 用于基因克隆的載體 質(zhì)粒（ plasmid） 噬菌體或病毒 DNA 考斯質(zhì)粒（ cosmid） 與噬菌粒 人造染色體載體 載體的功能及特征 載體的功能及特征 載體的功能 運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞 為外源基因提供復制能力或整合能力 為外源基因的擴增或表達提供必要的條件 載體應具備的條件 具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 具有合適的篩選標記 具有較 高的外源 DNA的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點 具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點 質(zhì)粒載體 質(zhì)粒的基本特征 A: 質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子； B: 質(zhì)粒常見于原核細菌和真菌中； C: 絕大多數(shù)的質(zhì)粒是 DNA型的； D: 絕大多數(shù)的天然 DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即 cccDNA； E: 質(zhì)粒 DNA的分子量范圍： 1 300 kb。 雙螺旋共價閉合環(huán)（超螺旋） 開環(huán)雙螺旋（一個裂口） 線狀雙螺旋（兩個裂口） 質(zhì)粒的分子形式 共價閉合環(huán)狀 DNA（ cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（ SC）（ super coil） 線形 DNA （ linear ， LDNA） 一條鏈上有一至數(shù)個缺口。 SC OC L 質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率 質(zhì)粒的自主復制性 質(zhì)粒能利用寄主細胞的 DNA復制系統(tǒng)進行自主復制質(zhì)粒 DNA上的復制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應關系根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲椭祁愋停? 嚴緊型質(zhì)粒 1 3 拷貝 stringent plasmid 松弛型質(zhì)粒 10 60 拷貝 stringent plasmid 任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)粒組成不相容性群 以大腸桿菌的質(zhì)粒為例： ColE pMB1 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 pSC10 F、 RP4 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容 質(zhì)粒的不相容性 質(zhì)粒的不相容性：分子機制 兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢 兩種含有不同復制子結(jié)構(gòu)的質(zhì)粒，復制時受各自拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，經(jīng)過若干復制和細胞分裂周期后仍能共處同一細胞內(nèi)。 大腸桿菌接合（ conjunction） 攜帶特殊的遺傳標記 野生型的質(zhì)粒 DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括： 物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬、毒性陰離子、有機物 物質(zhì)合成 抗生素、細菌毒素、有機堿 這些標記基因?qū)?DNA重組分子的篩選具有重要意義 質(zhì)粒的構(gòu)建 天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進行人工構(gòu)建。 但只有一個 EcoR I切點充當克隆位點， Tetr 作為篩選標志。 可以通過插入失活篩選。 唯一的克隆位點 EcoR I 正好位于這個基因的內(nèi)部。 a）抑菌原理， 通過干擾細菌細胞壁合成的末端反應，殺死生長的細菌。 ii）氯霉素（ chloramphenicol， Cml） b）細菌抗性原理： Cmlr 編碼乙酰轉(zhuǎn)移酶，特異地使氯霉素乙酰化而失活。殺死生長的細菌。殺死細菌。 iv）鏈霉素（ Streptomycin， Str） a）殺菌原理： 通過與 30S核糖體亞基結(jié)合，導致 mRNA錯譯。 b）細菌抗性原理： Strr 編碼一種氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶對鏈霉素進行修飾，阻斷其與核糖體 30S亞基結(jié)合作用。 a）抑菌原理： 通過于 30S核糖體亞基結(jié)合，干擾細胞蛋白質(zhì)的合成并阻止肽鍵的形成。 質(zhì)粒的分類 高拷貝質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù) 10003000 擴增基因 低拷貝質(zhì)粒 來自 pSC101 拷貝數(shù)小于 10 表達某些毒性基因