酶免疫分析技術(shù)ppt課件-展示頁
2025-01-29 00:30本頁面
【正文】 用。該法有一步法和二步法。此法酶標記物產(chǎn)率較高，但純化后仍有少量游離 IgG，部分結(jié)合物可能聚合，抗體的活性可能有所降低。 第七章 酶免疫分析技術(shù) （一）常用的標記方法 標記方法要求： ①方法簡單，產(chǎn)率高 ②不影響酶和抗體 (抗原 )的生物活性 ③所得酶結(jié)合物穩(wěn)定，本身不發(fā)生聚合 ④較少形成酶與酶、抗體與抗體或抗原與抗原的 聚合物 第七章 酶免疫分析技術(shù) 1．過碘酸鈉氧化法 僅用于 HRP的標記。 第七章 酶免疫分析技術(shù) 三、酶標抗體 (抗原 )的制備 制備要求： 抗原要求純度高、抗原性強。 βGal 的底物 4甲基傘酮基 βD半 乳糖苷（ 4MUG ） 酶作用后，生成高強度熒光物 ，用熒光計測量。 第七章 酶免疫分析技術(shù) （二）堿性磷酸酶 （ alkaline phosphatase， AP) 是一種磷酸酯水解酶，從大腸桿菌提取 AP的 底物 對 硝基苯磷酸酯（ pNPP ） 經(jīng) AP作用后的產(chǎn)物為黃色對硝基酚，最大吸收峰波長為405 nm。不穩(wěn)定，有致癌性。 第七章 酶免疫分析技術(shù) 二、酶和酶底物 標記酶的要求： ①活性高，純度高 ②作用專一性強 ③性質(zhì)穩(wěn)定，易與抗原或抗體偶聯(lián) ④測定方法簡便易行、敏感、精確 ⑤酶和底物對人體無害 ⑥酶和底物價廉易得 第七章 酶免疫分析技術(shù) （一）辣根過氧化物酶 （ horseradish peroxidase ,HRP） （主酶） 亞鐵血紅素（輔基） 主酶與酶活性無關(guān) 輔基是酶的活性中心 ： 403nm(輔基 )與 275nm(主酶 )OD值之比 ，酶活性單位比 RZ值更為重要 應(yīng)用最為廣泛 的標記用酶 第七章 酶免疫分析技術(shù) DH2十 H2O2— D十 2H20 HRP催化的反應(yīng)式為： DH2為供氫體，習(xí)慣稱為底物， H2O2為受氫體 HRP對受氫體的專一性很高，作用底物有多種。第七章 酶免疫分析技術(shù) 第七章 酶免疫分析技術(shù) 第七章 酶免疫分析技術(shù) 目 錄 概述 1 酶聯(lián)免疫吸附試驗 2 酶聯(lián)免疫吸附試驗的應(yīng)用和注意事項 3 其他酶標記免疫測定技術(shù) 4 返回總目錄 第七章 酶免疫分析技術(shù) 3 酶免疫分析技術(shù)的分類 克隆酶供體免疫測定 酶免疫分析技術(shù) 酶免疫組織化學(xué)技術(shù) 酶免疫測定技術(shù) 均相酶免疫測定 非均相酶免疫測定 酶放大免疫測定技術(shù) 液相酶免疫測定 固相酶免疫測定 第七章 酶免疫分析技術(shù) 第一節(jié) 概述 一、基本原理 酶免疫分析技術(shù)的 原理 是利用酶標記抗體(抗原 )形成酶標抗體 (抗原 )結(jié)合物，此結(jié)合物既保留抗體 (抗原 )的免疫活性，又保留了酶對底物的催化活性。酶標抗體 (抗原 )與相應(yīng)抗原 (抗體 )進行反應(yīng)后，酶催化相應(yīng)的底物顯色，借助酶作用于底物的 顯色反應(yīng) 來判定結(jié)果。 第七章 酶免疫分析技術(shù) 鄰苯二胺 OPD 四甲基聯(lián)苯胺 TMB 5氨基水楊酸 5ASA 2,2′ 氨基 二 (3乙基 苯并噻唑啉磺酸 6)銨鹽 ABTS HRP常用底物 第七章 酶免疫分析技術(shù) OPD反應(yīng)后顯 橙黃色 ，加酸終止反應(yīng)后呈 棕黃色 ，測定波長 492nm。 TMB反應(yīng)后顯 藍色 ，加酸終止反應(yīng)后變?yōu)?黃色 ,測定波長 450nm ，穩(wěn)定，無致癌性， ELISA中應(yīng)用最廣泛的底物。 第七章 酶免疫分析技術(shù) （三） β 半乳糖苷酶 （ βgalactosidase， βGal） 源于大腸埃希菌 ，常用于均相酶免疫測定。 第七章 酶免疫分析技術(shù) （四）其他酶 在商品試劑中，經(jīng)常應(yīng)用的酶還有葡萄糖氧化酶、 6磷酸葡萄糖脫氫酶、溶菌酶、青霉素酶、脲酶、蘋果酸脫氫酶等。 抗體則要求特異性強、效價高、親和力強、易于分離純化和批量生產(chǎn)?？膳c抗體蛋白的游離氨基結(jié)合，形成 HRPCH2NHIgG。 第七章 酶免疫分析技術(shù) 2．戊二醛交聯(lián)法 戊二醛分子中有兩個相同的醛基，可分別與酶和抗體（抗原）分子上的氨基結(jié)合。二步法標記效率比一步法高，酶標記物質(zhì)量較均一。 常用的純化方法有葡聚糖凝膠層析法和飽和硫酸銨沉淀法等。 （ 2） 酶標記率測定： 用分光光度法分別測定結(jié)合物中酶和抗體 (抗原 )蛋白的含量，然后按公式計算其標記率。 第七章 酶免疫分析技術(shù) （二）固相載體的種類 1．塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。 2．微顆粒 微顆粒是由高分子單體聚合成的微球 或顆粒。 第七章 酶免疫分析技術(shù) 微量反應(yīng)板 返回章目錄 第七章 酶免疫分析技術(shù)
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