【正文】 6150308 院 （系） 生命科學學院 專業(yè)、年級 生物科學 2006級 指導教師 莫小陽 副教授 二○一○年 四 月湖南師范大學本科畢業(yè)論文誠信聲明本人鄭重聲明：所呈交的本科畢業(yè)論文，是本人在指導老師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果，成果不存在知識產(chǎn)權(quán)爭議，除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體均已在文中以明確方式標明。 本科畢業(yè)論文作者簽名：（親筆簽名） 二○一○年 月 日（打印）一、湖南師范大學本科畢業(yè)論文開題報告書 （本頁全打?。?論 文 題 目作 者 姓 名所屬院、專業(yè)、年級 院 專業(yè) 年級指導教師姓名、職稱預計字數(shù)開題日期選題的根據(jù)：1）說明本選題的理論、實際意義 2）綜述國內(nèi)外有關(guān)本選題的研究動態(tài)和自己的見解主要內(nèi)容：研究方法： （打?。┩瓿善谙藓筒扇〉闹饕胧海ù蛴。┲饕獏⒖假Y料：（打?。┲笇Ы處熞庖姡? （指導教師手寫）簽 名： （親筆簽名） 年 月 日開 題 報 告 會 紀 要時間 （記錄人手寫） 地點（記錄人手寫）與會人員（記錄人手寫）姓 名職務(wù)（職稱）姓 名職務(wù)（職稱）姓 名職務(wù)（職稱）會議記錄摘要：（記錄人手寫）會議主持人簽名：記錄人簽名： 年　 月 日指導小組意見（由負責人本人手寫）負責人簽名： 年 月 日學 院 意 見負責人簽名： 年 月 日湖 南 師 范 大 學 學院指導教師指導畢業(yè)論文情況登記表論文（設(shè)計）題 目學生姓名所屬專業(yè)、年級 專業(yè) 級指導教師姓名職 稱學 歷指導時間指導地點指 導 內(nèi) 容學生簽名備 注 二、湖南師范大學本科畢業(yè)論文評審表 （本頁打?。┱撐念}目斑馬魚基因芯片實驗結(jié)果分析作者姓名彭湃所屬院、專業(yè)、年級生科 院 生物科學專業(yè)2006年級指導教師姓名、職稱莫小陽副教授字 數(shù)定稿日期中文摘要本文對斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因干擾相關(guān)基因芯片表達數(shù)據(jù)進行了信息學分析，篩選得到差役表達基因534個，信號通路119 條，分析發(fā)現(xiàn)wnt信號通路，轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路，MAPK信號通路等，與斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因功能相關(guān)，研究結(jié)果為研究斑馬魚胚胎發(fā)育過程中這些基因即信號通路與胚胎發(fā)育的關(guān)系提供了基礎(chǔ)，加深了對胚胎發(fā)育機理的理解。用語、格式、圖表、數(shù)據(jù)、量和單位、各種資料引用規(guī)范化、符合標準10論文篇幅文科類不少于10000字，理工科類不少于7000字，藝體類不少于5000字，外國語言文學類不少于5000個實詞?？偝煽儯秸牟糠殖煽儯馕馁Y料譯文成績。若譯文成績?yōu)榱?，則不計總成績，評定等級記為不及格。s disease（帕金森氏癥）……………………………………324．5．MAPK signaling pathway（MAPK信號通路）………………………334．6．Regulation of actin cytoskeleton（肌動蛋白細胞骨架調(diào)節(jié)）…………344．7．TGFbeta signaling pathway（轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路）…………344．8．Leukocyte transendothelial migration（白細胞經(jīng)內(nèi)皮遷移）…………364．9．Oxidative phosphorylation(氧化磷酸化) ………………………………364．10．Ribosome（核糖體）…………………………………………………364．11．Cell Communication（細胞通訊）……………………………………374．12．Cell cycle(細胞周期) …………………………………………………394．13. Ubiquitin mediated proteolysis（泛素介導的蛋白質(zhì)降解）…………39五、參考文獻……………………………………………………………………41致謝……………………………………………………………………………43摘要 基因芯片篩選斑馬魚胚胎FBL基因相關(guān)差異表達基因及信號通路 彭湃湖南師范大學生命科學學院生物科學專業(yè)2006級摘要：本文對斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因干擾相關(guān)基因芯片表達數(shù)據(jù)進行了信息學分析，篩選得到差役表達基因534個，信號通路119 條，分析發(fā)現(xiàn)wnt信號通路，轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路，MAPK信號通路等，與斑馬魚胚胎發(fā)育FBL基因功能相關(guān)，研究結(jié)果為研究斑馬魚胚胎發(fā)育過程中這些基因即信號通路與胚胎發(fā)育的關(guān)系提供了基礎(chǔ)，加深了對胚胎發(fā)育機理的理解。斑馬魚由于具有飼育容易、胚胎透明、體外受精、突變種多、遺傳學工具成熟等諸多優(yōu)點，近年來已成為研究脊椎動物發(fā)育與人類遺傳疾病的新興模式動物。這些突變種的表征包含如胚層分化，器官發(fā)育，生理調(diào)適與行為表現(xiàn)等多方面，所以可提供研究人員極佳的正向遺傳學材料來進行發(fā)育機制上的研究。所以正向遺傳學與逆向遺傳學的巧妙利用，可以正確推導出斑馬魚遺傳發(fā)育途徑。我們把斑馬魚的胚胎發(fā)育分為7個時期。時期hpf描述受精卵期0受精卵完成了第一次細胞分裂。囊胚期從快速的、同步的細胞周期（第9個）過渡到較長的、不同步的細胞周期；然后開始進行外包。分節(jié)期10體節(jié)、咽弓原基、神經(jīng)原節(jié)開始發(fā)育；開始進行主要器官發(fā)生；出現(xiàn)最早的運動；出現(xiàn)尾巴。孵化期48完成主要器官的快速形態(tài)發(fā)生；頭部和胸鰭的軟骨開始發(fā)育；孵化不同步的發(fā)生。 1細胞 2細胞 4細胞 8細胞 早期囊胚 中期囊胚 晚期囊胚 原腸胚期 24小時 一天 兩天 三天 幼魚 成魚1．斑馬魚心臟發(fā)育相關(guān)的基因及信號通路相關(guān)基因介紹： 心臟特異表達的轉(zhuǎn)錄因子是在早期的心臟區(qū)域被激活表達的。對于心臟前體細胞的分化最早的研究來源于果蠅。tinman基因編碼的是homeobox轉(zhuǎn)錄因子，這個因子屬于Nk2基因家族。在人和老鼠的心臟發(fā)育過程中， 的突變都能導致心臟發(fā)育的嚴重缺陷。目前，對于斑馬魚突變株faust（fau）和acerebellar（ace）的研究結(jié)果表明，他們影響了 ， fau/gata5， 而其表達的維持則需要 ace/fgf8。目前的試驗也證實了前端內(nèi)胚層對于誘導和維持心臟分化進程的重要作用。其中，BMP2 能夠在非心臟的區(qū)域誘導心肌細胞marker基因的表達。心臟分化起初不穩(wěn)定，需要一個持續(xù)不變動的環(huán)境刺激來保證心臟分化的穩(wěn)定發(fā)生。 GATA 基因家族 GATA家族是一類具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，在心臟的形成中也具有重要的作用。在斑馬魚中，GATA5的功能與老鼠中 GATA4的功能類似。同時心臟原始細胞向胚胎中軸遷移的過程也需要GATA5的參與，因此gata 5的突變體會導致兩側(cè)的心臟原始細胞最終不能融合而形成心臟二分（CardiaBifida）的表型。目前在斑馬魚和非洲爪蟾中越來越多的試驗證明，用反義morpholino寡聚核苷鏈工具使gata 6基因的功能缺失后，心臟細胞的分化受到了影響。在斑馬魚中已經(jīng)證明了GATA 。發(fā)揮著協(xié)同的激活效應：，導致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變， 的激活結(jié)構(gòu)域。激活下游某些心臟特異基因的表達。心臟的發(fā)育過程也遵循這樣的過程，首先在斑馬魚 6 個體節(jié)發(fā)育時期，心肌的前體細胞從前端的側(cè)板中胚層分化出來并且位于體軸的兩側(cè)。如果這一過程受阻，兩側(cè)的細胞不能正常會聚，則會出現(xiàn)心臟二分的表型。而后又有研究確定了非經(jīng)典的Wnt 信號途徑中參與這一過程的一些分子。同時Wnt4a和Wnt11r又被確定為調(diào)節(jié)會聚延伸過程的2個新型分子。非經(jīng)典Wnt信號通路下游有很多的分枝， 涉及這一過程調(diào)控的有Dvl/RhoA 分枝，另外還有Rho Kinase2分枝。而在雞胚的研究中卻發(fā)現(xiàn)神經(jīng)管分泌的Wnt信號能抑制前端鄰近的軸旁中胚層心臟的形成。這也說明關(guān)于Wnt 信號通路在斑馬魚心臟發(fā)育過程中的作用還有待進一步的研究。在胚胎24h的時候，心管呈現(xiàn)出向胚胎左側(cè)傾斜的趨勢。經(jīng)過48h之后，心室向右偏轉(zhuǎn)，心房則向左偏轉(zhuǎn)，這樣心房心室之間形成了一定的彎曲角度，且位于身體的左側(cè)，這個過程就是心臟的環(huán)化過程。從整個過程來看，斑馬魚心臟的左右不對稱性在心臟環(huán)化過程之前就已經(jīng)形成了。這個時期，BMP4為一環(huán)形表達區(qū)域，位于頭部中后腦邊界上方，并且左側(cè)側(cè)板中胚層的表達強于右側(cè)側(cè)板中胚層的表達。shh在很多系統(tǒng)中都證明位于 BMP4 途徑的上游。跟據(jù)報道，以斑馬魚為模型，采用能夠熱激活的斑馬魚系，研究 BMP4 信號在左右對稱中的影響發(fā)現(xiàn)，BMP信號主要影響了發(fā)育的2個時期。在 Kupffer’s vesicle中BMP4通過調(diào)節(jié)lefty1的表達抑制了spw的表達。試驗結(jié)果表明，BMP4對右側(cè)側(cè)板中胚層中spw表達的抑制，位于Nodal 信號途徑的上游。心臟是人體生存和活動必不可少的重要器官，因此人類的某些先天性心臟疾病或者后天形成的心臟疾病的研究就成為生物醫(yī)學領(lǐng)域的熱門。目前對于心臟發(fā)育的研究已經(jīng)深入分子研究的層次。對心臟發(fā)育的影響也只是其中的一種角色。這樣設(shè)計的致病方案或者篩選的藥物將不能精確地作用于心臟疾病，還可能影響到其他方面。這是深入了解心臟發(fā)育全過程的迫切需要，對指導臨床醫(yī)學有重要的意義。可阻擋RNA上約25個堿基的區(qū)域。嗎啉寡聚合苷酸（Morpholino oligonucleotides，MF）由美國著名的Gene Tools，LLC公司開發(fā)，是非離子型DNA類似物，其中的核糖被嗎啉代替（是以含有氮和氧的六元環(huán)代替RNA的五元核糖骨架）磷酸二酯鍵phosphoroamidate所取代，是進行反義抑制的有效方法。實驗證明這種結(jié)合是高度特異性的，長25個堿基的MFRNA中僅有4個堿基的錯配就可以造成抑制的目的基因翻譯能力的完全喪失。Morphoinos以嗎啉環(huán)類似物為基架，這種獨特的結(jié)構(gòu)特性使得Morphoinos具有以下幾個特點：，Morphoinos能更好地抵抗核酸酶的作用；，不激活RNaseH，不引起目標基因mRNA的降解；，針對premRNA剪切位點區(qū)設(shè)計的Morphoinos可影響mRNA剪切，得到不同的轉(zhuǎn)錄本，可以方便的用于目標基因結(jié)構(gòu)域的突變研究；，可以滲入mRNA的二級結(jié)構(gòu)，并且特異性好。實驗中采用MHC分子表達缺陷的細胞(RMAS細胞)與相崐應的多肽共育一定時間后,可誘導細胞表達MHC分子,這可能是缺陷細胞表達不穩(wěn)定的MHC重鏈,β2M復合體,當與多肽結(jié)合后就形成三分子的穩(wěn)定結(jié)構(gòu),使得MHC分子在崐細胞表面表達增加。如果多肽不與MHC分子形成穩(wěn)定結(jié)合,則它很崐難被MHC分子從胞內(nèi)遞呈出來。 合成多肽抗原性驗證的第二步,是將多肽與表達同一MHC分子的無關(guān)靶細胞共育,使多肽與靶細胞表面MHC分子結(jié)合,而后觀察特定抗原CTL細胞對多肽致敏靶細胞的殺傷活性,如果CTL能殺傷靶細胞,表明這一多肽可能被克隆CTL的TCR所識別,即為CTL所識別的抗