【正文】 抗體分子因有大小、帶電量、溶解度及其與抗原的作用不同，可分為不同的類和亞類。 ? 有限稀釋法 ：通過一系列稀釋，使每個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)孔平均 只含一個(gè)細(xì)胞 ，而分離細(xì)胞 ? 軟瓊脂法 ： 將雜交瘤細(xì)胞懸液分散在半固體營(yíng)養(yǎng)瓊脂糖上，使呈 單個(gè)細(xì)胞 定位生長(zhǎng)繁殖，以達(dá)到克隆化的目的。 （ 3）放射免疫技術(shù) ? 原理：將 同位素 分析的高靈敏度與 抗原抗體 反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以 放射性同位素 作為示蹤物的標(biāo)記免疫測(cè)定方法。以 熒光素 作為標(biāo)記物，與已知的抗體（或抗原）結(jié)合，然后將熒光素標(biāo)記的抗體或抗原作為標(biāo)準(zhǔn)試劑，用于檢測(cè)和鑒定抗原或抗體 。酶與抗體或抗原結(jié)合后，既不改變抗體或抗原的免疫學(xué)反應(yīng)的特異性，也不影響酶本身的酶學(xué)活性，在相應(yīng)而合適的作用底物參與下，使 基質(zhì)水解而呈色 ，或使供氫體由 無色的還原型 變?yōu)?有色的氧化型 ，從而表明某種抗原或抗體的存在。 ? 常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、脾細(xì)胞和胸腺細(xì)胞等。 ? 脾細(xì)胞具有 次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(HGPRT),因此脾 瘤融合的雜交瘤細(xì)胞可利用HGPRT酶 ,用次黃嘌呤 (H)和胸腺嘧啶 (T)合成DNA,使雜交瘤細(xì)胞得以生長(zhǎng)。 雜交瘤細(xì)胞的 選擇性培養(yǎng) ? 常用的選擇培養(yǎng)基為 HAT培養(yǎng)基 。這就要利用雜種細(xì)胞和親本細(xì)胞對(duì)生長(zhǎng)條件的要求和代謝的差異來進(jìn)行選擇。這就需要選擇分離純化雜種細(xì)胞。 可加入二甲基亞砜(DMSO)。 （ 2）應(yīng)用 ① 弱免疫原性物質(zhì)； ② 免疫原劑量不足。 : 體外免疫法；體內(nèi)免疫法 ? 體內(nèi)免疫法 顆粒性抗原 (如細(xì)菌、細(xì)胞 )的免疫原性強(qiáng) ,可不加佐劑 ,可溶性抗原則按每只小鼠 10100ug抗原與 弗氏完全佐劑 等量混合后注入腹腔內(nèi) . 弗氏完全佐劑 （ Freund’s plete adjuvant,FCA） : 由礦物油（如降脂烷或液體石蠟等）、乳化劑和滅活的分枝桿菌組成的乳化佐劑。 — 小鼠 (Balb/C,鼠齡 68周 )或 大鼠 (Lou)。這樣的雜交瘤細(xì)胞能長(zhǎng)期傳代同時(shí)分泌針對(duì)單一抗原上單一抗原表位的抗體，稱為 McAb（第二代抗體）。 ? 單克隆抗體 (Monoclonal antibody McAb): 由 一個(gè) 抗原決定簇 刺激的、 單一 的 B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞融合增殖后所產(chǎn)生的、高度均一 的抗體。 ? 多克隆抗體 : 一種抗原 具有 多個(gè) 抗原決定簇 ,每個(gè)抗原決定簇都能刺激 一個(gè) B細(xì)胞產(chǎn)生一種抗體。 ③以 1994年 Winter,創(chuàng)建了 噬菌體抗體庫(kù)(repertoire of antibodies displayed on phages)技術(shù) ,以基因工程方法制備抗體為代表。 ②以 1975年 Milstein amp。 ? IgE在血清含量最少。 ? IgM是五類免疫球蛋白中分子量最大的，為 五聚體 ,是對(duì)一個(gè)抗原作出反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生的 第一個(gè)抗體 ； ? IgA在黏膜表面、乳腺、淚腺形成，主要參 與局部的免疫反應(yīng) 。 免疫球蛋白 (immunoglobulin,Ig)分子量范圍從 150,000到 950,000道爾頓。 沙門氏桿菌 大腸桿菌 抗大腸桿菌的抗體 抗沙門氏桿菌的抗體 結(jié)合 結(jié)合 免疫球蛋白的結(jié)構(gòu) 抗體 ： 能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合的具有 免疫功能的球蛋白 。 6 目前，在中草藥中發(fā)現(xiàn)廣泛存在半抗原，如小檗堿、茶堿、丹參酮等，具有生化活性基因的化學(xué)成分都有可能成為半抗原，這些半抗原可與體內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合成完全抗原，造成一些過敏反應(yīng)。是指其本身只有反應(yīng)原性， 但沒有免疫原性的簡(jiǎn)單小分子的抗原物質(zhì)。 5 ? 完全抗原： 既具有免疫原性，又具有反應(yīng)原性的抗原。 4 ? 免疫原性 ：指能刺激機(jī)體 產(chǎn)生 抗體和 /或致 敏淋巴細(xì)胞的性能。 第七章 抗體工程制藥 一 .概述 抗體 (工程 )制藥 — 生物技術(shù)制藥領(lǐng)域的重要組成部分 ? 抗 原 (antigen,Ag) 是指那些能夠刺激和 /或誘導(dǎo)機(jī)體免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答、產(chǎn)生抗體和 /或致敏（效應(yīng)）淋巴細(xì)胞，同時(shí)又能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物在體內(nèi)外特異性結(jié)合，發(fā)生免疫反應(yīng)的物質(zhì)。 如：病原微生物、免疫血清、藥物、疫苗 ? 對(duì)機(jī)體來說，抗原相當(dāng)于一個(gè)國(guó)家已知的或潛在的、外部的或內(nèi)部的 “ 敵人 ”。 ? 反應(yīng)原性： 能與相應(yīng)的抗體和 /或淋巴細(xì)胞 發(fā)生 特異性結(jié)合 ，發(fā)生反應(yīng)的性能。 如微生物、異種血清 ?半抗原： 又稱 不完全抗原 。如 某些藥物（青霉素，等）、多糖、類脂。 7 ? 抗原的特異性既表現(xiàn)在免疫原性上，也表現(xiàn)在反應(yīng)原性上。 抗體的產(chǎn)生過程： 機(jī)體免疫系統(tǒng)受抗原物質(zhì)刺激后， B淋巴細(xì)胞 被激活，增殖和分化為漿細(xì)胞，由漿細(xì)胞合成和分泌的球蛋白。 分五類： ? IgG在血清中含量最高，達(dá) 75~80%,是抗感染 的主要抗體 。 ? IgD在血清中含量很低 。 免疫球蛋白 IgG IgM IgA IgD IgE 動(dòng)物血清中產(chǎn)生抗體的時(shí)間示意圖 抗原刺激的第一至三周， IgM生成；抗原再刺激后， IgＧ將取代 IgM 抗體研究的發(fā)展階段： ①以 1890年 Behring發(fā)現(xiàn) 白喉抗毒素 為代表 ,用抗原免疫動(dòng)物來獲得 多克隆抗體 。 Kohler創(chuàng)建 雜交瘤技術(shù)制備 單克隆抗體 (McAb)為代表。在此基礎(chǔ)上發(fā)展成抗體工程。這樣所獲得的免疫血清是多種抗體的混和物。 1 2 3 4 多克隆抗體和單克隆抗體 Pure single Ab After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies. Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to i ts specific antigen. Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced by B cells from spleen. If a single B cell was picked up and cultured, then it will prod uce only one kind of antibody. But B cell can not survive well in the culture. Each hybridoma line can produce pure single antibody, called mon oclonal antibody. If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be culture d and produce antibody.Adapted from M ilstein (1980) Scientific American , Oct. 1 2 3 4 m m m m 1