【正文】 、 快速； —— 大多采用色譜及其脫線或在線聯(lián)用技術(shù) ， 如 HPLC、 LCMS 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 8 二、分析測(cè)定的目的與要求 ?臨床治療藥物監(jiān)測(cè) ?有效治療濃度范圍內(nèi)藥物濃度 方法 —— 盡量簡(jiǎn)便 、 易行；適用于長(zhǎng)期 、 批量樣品的測(cè)定 —— 大多采用 UV、 RIA或 EIA等 ?中毒患者的臨床搶救 ?藥物濃度極高 方法 —— 不必強(qiáng)調(diào)方法的靈敏度 ， 強(qiáng)調(diào)方法的 特異性 和 分析速度 —— 大多采用色譜及其聯(lián)用技術(shù) GC、 GCMS、 RIA或 EIA 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 9 三、生物樣品的類型與預(yù)處理方法 生物樣品的類型與預(yù)處理方法 —— 決定分析方法的應(yīng)用 ?以血漿或血清為分析樣品 采用蛋白沉淀 溶劑萃取預(yù)處理技術(shù) —— 分析樣品較為 “ 干凈 ” ， 可用 HPLC檢測(cè) ?用 RIA分析 —— 樣品的預(yù)處理方法可較為粗放 —— 經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的蛋白沉淀或不經(jīng)任何預(yù)處理直接測(cè)定 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 10 四、實(shí)驗(yàn)室條件 在設(shè)計(jì)體內(nèi)藥物分析方法時(shí) ， 還應(yīng)充分考慮到實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的或有可能在其它實(shí)驗(yàn)室使用的儀器裝備 ， 合理選擇可行的分析方法 。 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第一節(jié) 分析方法的設(shè)計(jì)依據(jù) 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 11 第二節(jié) 分析方法 建立的一般步驟 ?一 、 分析方法的選擇 ?二 、 分析方法的建立 (一 ) 檢測(cè)條件的篩選 (二 ) 分離條件的篩選 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 12 一、分析方法的選擇 體內(nèi)藥物分析方法的設(shè)計(jì) 生物樣品中的 藥物濃度 —— 決定分析方法的 首要因素 生物樣品中藥物或其特定代謝產(chǎn)物的濃度低 、 樣品量少 —— 難以通過(guò) 增加取樣量 提高方法靈敏度 —— 通過(guò) 選擇適當(dāng)?shù)姆治龇椒?適應(yīng)樣品分析需求 體內(nèi)藥物分析中常用分析方法 —— 特點(diǎn)見(jiàn) 表 41 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 13 二、分析方法的建立 ? 分析方法建立之前 查閱文獻(xiàn)資料 —— 充分了解藥物在體內(nèi)的 動(dòng)力學(xué)過(guò)程 ， 使所擬定的分析方法 —— 避免受到代謝產(chǎn)物的干擾適用于實(shí)際生物樣品測(cè)定 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 14 二、分析方法的建立 ? 初步擬定分析方法后 進(jìn)行一系列試驗(yàn)工作 —— 選擇最佳分析條件 同時(shí) 驗(yàn)證分析方法的可行性 —— 確認(rèn)是否適用于實(shí)際生物樣品 ? 分析方法的 建立 和 驗(yàn)證 過(guò)程 —— 是不可截然劃分的 —— 為便于討論而分別敘述 ? 分析方法的建立步驟 ?第一步：檢測(cè)條件的篩選 ?第二步：分離條件的篩選 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 15 (一 )檢測(cè)條件的篩選 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) —— 照擬定的分析方法 (不包括生物基質(zhì)的預(yù)處理 )測(cè)定 —— 確定最佳分析檢測(cè)條件 (如 色譜條件 )和 檢測(cè)靈敏度 HPLC —— 調(diào)整 檢測(cè)器 (類型 、 條件 ) 色譜柱 (型號(hào) 、 牌號(hào) 、 填料性狀與粒經(jīng) 、 柱長(zhǎng)度 ) 流動(dòng)相 (組分及其配比 )及其流速 柱溫 、 進(jìn)樣量 、 內(nèi)標(biāo)物質(zhì) 的濃度及其加入量等 —— 使各物質(zhì)具有 足夠的方法靈敏度 (LOQ) 良好的色譜參數(shù) (n、 R、 T) 適當(dāng)?shù)谋Ａ魰r(shí)間 (tR) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 16 (二 )分離條件的篩選 在進(jìn)行分離條件篩選時(shí) ， 應(yīng)考察生物基質(zhì)中的內(nèi)源性物質(zhì)及代謝產(chǎn)物對(duì)分離與檢測(cè)的干擾 ， 步驟如下： 1． 空白溶劑試驗(yàn) —— 溶劑 (方法特異性 ) 2． 空白生物基質(zhì)試驗(yàn) —— endogenous pounds(方法特異性 ) 3． 模擬生物樣品試驗(yàn) —— 方法效能指標(biāo) 4． 實(shí)際生物樣品測(cè)試 —— 代謝產(chǎn)物 (方法特異性 ) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 17 1．空白溶劑試驗(yàn) 待測(cè)藥物的 非生物基質(zhì)溶液 （ 通常為水溶液 ） —— 采用 擬定的分析方法進(jìn)行 衍生化反應(yīng) 、 萃取分離等 樣品 預(yù)處理 （ 反應(yīng)試劑 、 衍生化試劑 、 萃取溶劑等 ） —— 測(cè)定 響應(yīng)信號(hào) （ 如 HPLC峰面積或峰高 ） 考察目標(biāo) — — 方法的 特異性 —— 空白值應(yīng)盡可能小 ， 并能有效校正 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 18 色譜分析法 —— 可通過(guò) 改變反應(yīng)條件 、 萃取方法或萃取條件 （ 萃取溶劑的極性 、 混合溶劑的配比 ， 固相萃取填料性質(zhì) 、 沖洗劑與洗脫劑及其用量等 ） ， 甚至 檢測(cè)器類型 —— 空白試劑信號(hào)應(yīng) 不干擾藥物的測(cè)定 （ 如 R＞ ） 本步驟主要考察 —— 需經(jīng)化學(xué)反應(yīng)的預(yù)處理過(guò)程 ， 若預(yù)處理過(guò)程僅為生物樣品的提取分離 ， 則可不進(jìn)行該步驟 ， 直接進(jìn)行空白生物基質(zhì)試驗(yàn) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 19 2. 空白生物基質(zhì)試驗(yàn) 空白生物基質(zhì) (blank biological matrix) —— 如 空白血漿 —— 照 “ 1. 空白溶劑試驗(yàn) ” 項(xiàng)下方法操作 考察目標(biāo) —— 生物基質(zhì)中 內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測(cè)定的干擾 （ 方法特異性 ） —— 在待測(cè)藥物 (或特定的活性代謝物 、 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)等 )的 “ 信號(hào)窗 ”（ 信號(hào)附近的有限范圍 ） 內(nèi)不應(yīng)出現(xiàn) 內(nèi)源性物質(zhì)信號(hào) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 20 3. 模擬生物樣品試驗(yàn) 模擬生物樣品 (質(zhì)量控制 ,QC樣品 )—— 空白生物基質(zhì)中加入待測(cè)藥物 —— 照 “ 1. 空白溶劑試驗(yàn) ” 項(xiàng)下方法操作 考察目標(biāo) —— 方法的 線性范圍 、 精密度與準(zhǔn)確度 、 靈敏度 藥物的 萃取回收率 等各項(xiàng)技術(shù)指標(biāo) —— 同時(shí) 進(jìn)一步 檢驗(yàn)生物基質(zhì)中內(nèi)源性物質(zhì)以及可能共同使用的其他藥物對(duì)測(cè)定的干擾程度 ， 即 方法特異性 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 21 色譜分析法 —— 進(jìn)一步考察待測(cè)藥物 (或內(nèi)標(biāo)物 )與內(nèi)源性物質(zhì) (或其它藥物 )的分離情況 —— 色譜峰的 tR、 n 和 T 是否與水溶液的 一致 色譜峰是否為 單一成分 標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距是否顯著 偏離零點(diǎn) 等 —— 內(nèi)源性物質(zhì)是否對(duì)待測(cè)藥物或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)構(gòu)成干擾 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 22 4. 實(shí)際生物樣品的測(cè)試 空白生物基質(zhì)和模擬生物樣品試驗(yàn) —— 確定的分析方法及其條件 —— 不能完全確認(rèn)是否適合于實(shí)際生物樣品的測(cè)定 —— 藥物在體內(nèi)可能與內(nèi)源性物質(zhì)結(jié)合 (如 血漿蛋白結(jié)合物 ) 或代謝生成數(shù)個(gè) 代謝產(chǎn)物 及其進(jìn)一步的 結(jié)合物 (或綴合物 ) 實(shí)際生物樣品 —— 確立分析方法后 ， 尚需進(jìn)行實(shí)際生物樣品的測(cè)試 考察目標(biāo) —— 代謝產(chǎn)物 對(duì)藥物 、 內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的 干擾 情況 —— 進(jìn)一步 驗(yàn)證方法的可行性 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第二節(jié) 分析方法的建立步驟 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 23 第三節(jié) 分析方法 驗(yàn)證的內(nèi)容與要求 用于實(shí)際生物樣品分析之前 —— 驗(yàn)證 (validation) 分析方法的 可行性 與 可靠性 方法驗(yàn)證時(shí)應(yīng)考慮影響分析方法 —— 所有可變因素 (采樣 ,樣品制備 ,色譜分離 ,檢測(cè)與數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)等 ) 使用的 技術(shù)指標(biāo) —— 效能指標(biāo) 使用的 樣品 —— 通常采用 模擬生物樣品 和用藥后的 實(shí)際生物樣品 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 24 驗(yàn)證步驟 首先為 分析方法 的驗(yàn)證 —— 特異性 、 精密度與準(zhǔn)確度 、 回收率 定量限與檢測(cè)限 、 溶液穩(wěn)定性 其次為 生物基質(zhì)中 待測(cè)藥物 穩(wěn)定性 的驗(yàn)證 —— 室溫放置 、 冷凍 （ 或冷藏 ） 、 凍 融循環(huán) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 25 驗(yàn)證的效能指標(biāo)與基本要求 1． 特異性 —— 避免干擾 2． 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍 —— 覆蓋所有濃度范圍 3． 準(zhǔn)確度 —— 與實(shí)際狀況相符 4． 精密度 —— 結(jié)果可重現(xiàn) 5． 定量限 —— 達(dá)到峰濃度的 1/10～ 1/20 6．