【正文】 五、定量限 方法定量限 (limit of quantitation， LOQ) —— 系指在保證具有一定可靠性 (準(zhǔn)確度與精密度符合要求 )的前提下 ， 能測(cè)定出生物樣品中藥物的最低濃度 —— 又稱(chēng)為方法靈敏度 (sensitivity) —— 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上的最低濃度點(diǎn) (最低濃度點(diǎn) ≥LOQ) 要求 —— 應(yīng)能滿(mǎn)足測(cè)定 3～ 5個(gè)消除半衰期后生物樣品中的藥物濃度 —— 準(zhǔn)確度在 80%～ 120%(或 RE在 177。 20%的范圍內(nèi) ) —— RSD＜ 20% 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 51 六、穩(wěn)定性與質(zhì)量控制 穩(wěn)定性 —— 包括方法穩(wěn)定性和樣品穩(wěn)定性 方法穩(wěn)定性 —— 方法的耐用性 樣品穩(wěn)定性 —— 生物樣品的存放條件和時(shí)間 、 凍 融循環(huán) 測(cè)定法 —— QC樣品穿插于實(shí)際樣品測(cè)定全過(guò)程 —— 模擬 (或?qū)嶋H )生物樣品及其預(yù)處理后的待測(cè)溶液進(jìn)行考察 要求 —— 準(zhǔn)確度 85%～ 115%(RE在 177。 15%范圍內(nèi) )， RSD＜ 15% 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 52 七、萃取回收率 生物樣品的預(yù)處理方法 —— 重點(diǎn)考慮 方法準(zhǔn)確度 (或 相對(duì)回收率 )， 操作簡(jiǎn)便 、 快速 —— 萃取回收率 (絕對(duì)回收率 ， absolute recovery)， ≥70% 萃取回收率與相對(duì)回收率的意義不同 萃取回收率 —— 考察生物樣品預(yù)處理過(guò)程造成的藥物的程度損失 相對(duì)回收率 —— 采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)可準(zhǔn)確計(jì)算生物樣品中藥物濃度 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 53 1. 測(cè)定法 取空白生物基質(zhì) (如血漿 )， 照準(zhǔn)確度項(xiàng)下方法 ， 制備高 、 中 、 低3個(gè)濃度的 QC樣品 (每一濃度至少 5個(gè)樣品 )， 每個(gè)樣品分析測(cè)定 1次 另取等量的相同 3個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液 ， 用溶解模擬生物樣品經(jīng)提取處理后的殘?jiān)娜軇┫♂屩镣w積 ， 同法測(cè)定 AT—— 經(jīng)萃取后的 QC樣品的檢測(cè)信號(hào)或比值 (內(nèi)標(biāo)法 ) AS—— 未經(jīng)萃取的標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢測(cè)信號(hào)或比值 (內(nèi)標(biāo)法 ) ）（ %1 0 0??STAAR第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 54 2. 限度要求 萃取回收率一般應(yīng) ≥50% 高 、 中濃度的 RSD應(yīng) ≤15% 低濃度的 RSD應(yīng) ≤20%。 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 55 第四節(jié) 體內(nèi)藥物分析方法 應(yīng)用示例 第三代喹諾酮類(lèi)廣譜抗菌藥 鹽酸環(huán)丙沙星片人體生物等效性 研究 一 、 文獻(xiàn)調(diào)研 性質(zhì) —— 在水中溶解 ， 在甲醇中微溶 ， 在乙醇中極微溶解 ， 在氯仿中幾乎不溶 ， 在氫氧化鈉試液中易溶；環(huán)丙沙星游離體在水中不溶 ，在乙醇 、 二氯甲烷中極微溶解 ， 在稀醋酸中溶解 。 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 NOFNNOO H, H C l , H 2 O2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 56 藥動(dòng)學(xué)參數(shù) 吸收過(guò)程 —— 空腹口服后吸收迅速 、 人體生物利用度約為 49%～ 70% Cmax —— 口服 500mg后平均 Cmax為 ～ Tmax —— 1～ 2h T1/2 —— 血中 T1/2約為 4h， 腎功能減退時(shí)稍有延長(zhǎng)至 6h 蛋白結(jié)合率 —— 20%～ 40% 代謝 —— 口服給藥 24h內(nèi) ， 40%～ 50%原形 、 15%代謝物經(jīng)腎排出 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 57 體內(nèi)分析方法 RPHPLC 色譜柱 —— ODS色譜柱 流動(dòng)相 —— 甲醇 (乙腈 )磷酸 (枸櫞酸 )緩沖液 (三乙胺調(diào)節(jié) ～)， 或 離子對(duì)色譜 : 溴化十六烷基三甲基銨 (氫氧化四丁基銨 ) 檢測(cè) —— 紫外或熒光檢測(cè) 生物樣品預(yù)處理 蛋白沉淀法 —— 甲醇 、 乙腈或高氯酸沉淀蛋白后直接進(jìn)樣 溶劑萃取法 —— 二氯甲烷 異丙醇 、 氯仿 異丙醇混合溶劑 蛋白沉淀 溶劑萃取 —— 乙腈沉淀蛋白后二氯甲烷 異丙醇提取 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 58 二、分析方法設(shè)計(jì) 1． 分析方法 血漿蛋白結(jié)合率低 (20%～ 40%)、 以原形從腎排泄 生物等效性研究 —— 測(cè)定血漿中環(huán)丙沙星原形藥物的濃度 時(shí)間曲線(xiàn) 。 初步擬定 ：采用 RPHPLC法 2． 檢測(cè)方法 紫外 —— 靈敏度＜ 1ng， 若取血漿 ， 采用 3倍量乙腈沉淀蛋白 ， 取上清液 100?l進(jìn)樣 ， 則要求血漿中環(huán)丙沙星濃度在 50ng/ml以上 ，當(dāng) Cmax在 2?g/ml以上 (口服 500mg)時(shí) 基本可滿(mǎn)足 生物等效性研究要求 熒光 —— 靈敏度＜ ， 能 滿(mǎn)足 本試驗(yàn)要求 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 59 二、分析方法設(shè)計(jì)（續(xù)） 3． 樣品制備方法 初步擬定 —— 采用簡(jiǎn)便 、 快速的乙腈沉淀蛋白后取上清液直接進(jìn)樣分析 預(yù)試 —— 含 75%乙腈的提取液 100?l進(jìn)樣后 ， 色譜峰理論板數(shù) 、對(duì)稱(chēng)性下降 (前沿峰 )， 進(jìn)而導(dǎo)致檢測(cè)靈敏度降低 (峰高降低 ) 經(jīng)進(jìn)一步試驗(yàn) ， 確定為： 血漿 → 乙腈 1ml沉淀蛋白 → 二氯甲烷 異丙醇 (95:5)5ml萃取→ 60℃ 氮?dú)饬鞔蹈?→ 流動(dòng)相 200?l溶解 → 20?l進(jìn)樣 靈敏度可達(dá) 2ng/ml(血漿濃度 )， 符合要求 (Cmax＞ 2?g/ml) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 60 三、實(shí)驗(yàn)方案 1． 給藥方案 20名受試者隨機(jī)分為兩組 ， 每組 10人 第 1次試驗(yàn) —— 第一組口服受試制劑 (相當(dāng)于環(huán)丙沙星500mg)， 第二組口服相同劑量的參比制劑 第 2次試驗(yàn) —— 第 1次服藥后第 7天開(kāi)始 ， 兩組交換給藥 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 61 三、實(shí)驗(yàn)方案（續(xù)） 2． 血樣的采集與處理 分別口服給藥前和給藥后 、 、 、 (tmax)、 、 、 、 、 (5~7個(gè) t1/2)小時(shí) 由肘正中靜脈取血 4 ml 立即移入經(jīng)肝素處理的離心試管中 ， 靜置 5分鐘后 ， 離心 15分鐘(3000rpm)， 分離血漿 20℃ 冰箱中保存待測(cè) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 62 三、實(shí)驗(yàn)方案（續(xù)） 3． 血樣分析法 色譜條件 —— 高效液相色譜儀 (包括 LC10ATvp泵 ， RF530熒光檢測(cè)器 )；色譜柱為 Kromasil ODSAP(200mm mm， 5?m) —— 流動(dòng)相為乙腈 (86:14)， 流速 —— 檢測(cè)波長(zhǎng)為 ?ex=277nm， ?em=445nm —— 柱溫為 40℃ 。 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 63 三、實(shí)驗(yàn)方案（續(xù)） 3． 血樣分析法 血漿樣品的預(yù)處理 取血漿 ， 加內(nèi)標(biāo)溶液 (10?g/ml諾氟沙星甲醇溶液 ） 50 ?l、 乙腈 ， 渦旋混合 30s， 離心 5min， 取上清液 1ml， 加二氯甲烷 異丙醇 (95:5)混合溶劑 5ml， 渦旋振蕩 1min， 離心 5min， 棄去上層水相 ， 吸取下層有機(jī)相 ， 60℃ 下氮?dú)饬鞔蹈?， 殘?jiān)恿鲃?dòng)相 200?l， 渦旋溶解30s， 離心 5min， 取上清液 20?l進(jìn)樣 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 64 四、分析方法驗(yàn)證 1． 方法特異性 環(huán)丙沙星峰 tR=， 諾氟沙星 (內(nèi)標(biāo)物質(zhì) )tR=， 各峰均獲得完全分離 ， 內(nèi)源性物質(zhì)峰 (與空白血漿樣品一致 )tR=無(wú)干擾 志愿者用 藥后的血漿樣品 色譜圖中環(huán)丙沙星與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰與 模擬血漿樣品 中環(huán)丙沙星與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的 tR、 T、 n和 R均一致 ， 峰形相同 。故不認(rèn)為代謝物有干擾 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求 2022/2/2 體內(nèi)藥物分析 65 四、分析方法驗(yàn)證 (續(xù) ) 2． 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 —— 取鹽酸環(huán)丙沙星 ， 加水制成 20和 50?g/ml的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液 ， 冰箱保存 標(biāo)準(zhǔn)系列模擬血漿樣品 —— 取空白血漿 ， 加環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)系列溶液各 50?l， 配制成相當(dāng)于濃度為 ， 、 、 、 、 ?g/ml的 QC樣品 ， 冰凍 (20℃ ) 測(cè)定法 —— 取 QC樣品 ， 照 “ 血漿樣品的預(yù)處理 ” 項(xiàng)下方法操作 ，以環(huán)丙沙星濃度 C為橫坐標(biāo) ， 環(huán)丙沙星與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積比值 Y為縱坐標(biāo) ， 用加權(quán)最小二乘法經(jīng) Excel運(yùn)算 ， 求得的直線(xiàn)回歸方程為：Y=， R2=(C=～ ?g/ml) 第四章 分析方法的建立與驗(yàn)證 第三節(jié) 分析方法的驗(yàn)證與要求