核酸提取及常見問題分析ok-展示頁
2025-05-21 21:40本頁面
【正文】 菌體在懸浮液中充分懸浮 ? 變性的時間不要過長（ 5分鐘），否則質(zhì)粒易被打斷 ? 復(fù)性時間也不宜過長，否則會有基因組 DNA的污染 ? G＋ 菌、酵母質(zhì)粒的提取，應(yīng)先用酶法或機(jī)械法處理，以破壁 核酸分離、純化 ? 采用吸附材料吸附的方式分離 DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系 ? 采用有機(jī)（酚 /氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔 ? 離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間 ? 針對不同材料的特點(diǎn)，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法 基因組 DNA的提取 質(zhì)粒 DNA的提取 核酸分離、純化 ?蛋白質(zhì)的去除： ? 酚 /氯仿抽提 ? 使用變性劑變性（ SDS、異硫氰酸胍等） ? 高鹽洗滌 ? 蛋白酶處理 ?多糖的去除： ? 高鹽法：用乙醇沉淀時，在待沉淀溶液中加入 1/2體積的 5M NaCl，高鹽可溶解多糖。 ? 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì)（蔗糖）中，以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心，比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降，比重小的卻處于上層，從而得以分離。 質(zhì)粒 DNA－堿裂解法 ? 堿裂解法流程圖 對數(shù)期菌體 溶液 III中和 溶液 I充分重懸 溶液 II裂解 上清液 抽提 離心洗滌 酒精沉淀 干燥溶解 沉淀 質(zhì)粒 DNA溶液 質(zhì)粒 DNA－煮沸法 ? 煮沸法原理 ? 染色體 DNA比質(zhì)粒 DNA分子大得多，且染色體 DNA為 線狀分子，而質(zhì)粒 DNA為共價閉合環(huán)狀分子； ? 當(dāng)加熱處理 DNA溶液時，線狀染色體 DNA容易發(fā)生變性，共價閉環(huán)的質(zhì)粒 DNA在冷卻時即恢復(fù)其天然構(gòu)象； ? 變性染色體 DNA片段與變性蛋白質(zhì)和細(xì)胞碎片結(jié)合形成沉淀，而復(fù)性的超螺旋質(zhì)粒 DNA分子則以溶解狀態(tài)存在液相中，從而可通過離心將兩者分開。 磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物，從而達(dá)到分離目的。 低鹽高 pH值結(jié)合核酸，高鹽低 pH值洗脫。 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ pH ） NaCl SDS 終濃度 10 mM 20 mM 2% ? SDS法 DNA提取緩沖液 ? SDS法流程圖 （以動物組織為例） 動物組織 細(xì)胞裂解 上層溶液 組織勻漿 抽提 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組 DNA－ SDS法 基因組 DNA－其它方法 ? 物理方式 ：玻璃珠法、 超聲波法、研磨法、凍融法 ? 化學(xué)方式 ：異硫氰酸胍法、堿裂解法 ? 生物方式 ：酶法 ? 根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有： 基因組 DNA－其它方法 ? 吸附材料結(jié)合法： ? 根據(jù)核酸分離純化方式的不同有： ? 硅質(zhì)材料 ? 陰離子交換樹脂 ? 磁珠 高鹽低 pH值結(jié)合核酸，低鹽高 pH值洗脫。 ? CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ ） NaCl CTAB β巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 2%(W/V) %（ V/V）使用前加入 ? TrisHCl （ ） 提供一個緩沖環(huán)境，防止核酸被破壞； ? EDTA螯合 Mg2+或 Mn2+離子，抑制 DNase活性； ? NaCl 提供一個高鹽環(huán)境，使 DNP充分溶解，存在于液相中； ? CTAB溶解細(xì)胞膜，并結(jié)合核酸，使核酸便于分離； ? β巰基乙醇是抗氧化劑，有效地防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除 基因組 DNA－ CTAB法 ? CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方 組份 TrisHCl （ ） EDTA （ ） NaCl CTAB PVP40 β巰基乙醇 終濃度 100 mM 20 mM 3%(W/V) 5%(W/V) 2%（ V/V）使用前加入 ? PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡(luò)合物
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