【正文】 在三維培養(yǎng)干細(xì)胞中的示蹤技術(shù)，開展基于熒光成像的二維、三維培養(yǎng)干細(xì)胞分化過程定量分析手段。3〕活體干細(xì)胞的特異性標(biāo)記：用近紅外量子點(diǎn)或磁性納米粒子對(duì)三維培養(yǎng)的干細(xì)胞在體外進(jìn)行標(biāo)記，采用立體定位注射的方法導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，利用近紅外量子點(diǎn)的熒光信號(hào)或磁性納米粒子的核磁信號(hào)對(duì)活體內(nèi)的干細(xì)胞進(jìn)行定位與跟蹤，為研究其在體內(nèi)生理環(huán)境下的增殖與分化機(jī)制提供證據(jù)?！?〕 高生物相容性和高弛豫率磁性納米顆粒的制備：通過控制納米粒的粒徑、化學(xué)成分以及外表性質(zhì)使其具有良好的弛豫性能和生物相容性。、陳倩經(jīng)費(fèi)比例：18%課題4：干細(xì)胞的納米示蹤與成像技術(shù)研究目標(biāo)：建立干細(xì)胞納米示蹤與成像新技術(shù)，包括制備出高生物相容性、高量子產(chǎn)率的量子點(diǎn)，建立量子點(diǎn)標(biāo)記活細(xì)胞及亞細(xì)胞組分的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)三維培養(yǎng)干細(xì)胞以及活體干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，建立三維培養(yǎng)干細(xì)胞和活體干細(xì)胞的三維、非損傷性的納米示蹤與成像技術(shù)。承當(dāng)單位：中國科學(xué)院動(dòng)物研究所 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 課題負(fù)責(zé)人：唐鐵山學(xué)術(shù)骨干：丁梅、關(guān)麗英、4) 外源神經(jīng)干細(xì)胞參與神經(jīng)功能的恢復(fù)使用神經(jīng)退行性疾病模型小鼠—舞蹈病模型小鼠作為外源神經(jīng)干細(xì)胞的受體。在細(xì)胞導(dǎo)入后不同時(shí)間分別使用增殖細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞、分化細(xì)胞、成熟神經(jīng)元、神經(jīng)突觸等特異的分子標(biāo)記，系統(tǒng)地檢測外源神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的維持、分化行為以及功能回路的建立。3〕 三維培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞在小鼠紋狀體區(qū)的維持、分化與神經(jīng)回路的重建將使用近紅外量子點(diǎn)和磁性納米顆粒對(duì)三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在體外進(jìn)行標(biāo)記。運(yùn)用細(xì)胞自主性拯救實(shí)驗(yàn)探明該因子調(diào)控內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞維持與分化的分子機(jī)制。研究內(nèi)容：1〕線蟲內(nèi)源神經(jīng)干細(xì)胞維持與分化的關(guān)鍵因子首先建立線蟲神經(jīng)干細(xì)胞體內(nèi)觀察體系，利用線蟲容易進(jìn)行大規(guī)模篩選的特性，進(jìn)行全基因組RNAi篩選和化學(xué)誘變。明確三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的自我更新能力與分化潛能，并對(duì)其導(dǎo)入體內(nèi)后的有效性、平安性進(jìn)行評(píng)估。4〕利用已建立的人胚胎干細(xì)胞向心肌分化的體外培養(yǎng)模型,在三維培養(yǎng)條件下利用基因芯片或深度測序的方法取得基因表達(dá)譜，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建三維條件下心肌分化的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)。2〕運(yùn)用生化方法檢測并比擬二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞分化過程中受外界信號(hào)因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化，分析它們各自信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑整合的特性。研究內(nèi)容：1〕選擇成體干細(xì)胞包括神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞，將干細(xì)胞接種于三維支架材料上，檢測比擬二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞功能等。承當(dāng)單位：中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所 大連醫(yī)科大學(xué)課題負(fù)責(zé)人：戴建武學(xué)術(shù)骨干：汪迎春、劉蕾、丁文勇、林琳、田余祥經(jīng)費(fèi)比例：34%課題2：三維培養(yǎng)干細(xì)胞的定向分化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究研究目標(biāo)：綜合運(yùn)用細(xì)胞生物學(xué)、生物化學(xué)、材料科學(xué)及系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，檢測三維培養(yǎng)中干細(xì)胞自我更新和分化狀態(tài)的各項(xiàng)指標(biāo)，以建立一套完善有效的干細(xì)胞三維培養(yǎng)的評(píng)價(jià)體系。5〕三維培養(yǎng)干細(xì)胞的自我更新研究建立ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞三維培養(yǎng)體系根底上，研究調(diào)控細(xì)胞多能性的這些因子之間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，解析其如何相互協(xié)同共同控制多能性細(xì)胞的不分化狀態(tài)。4〕三維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞發(fā)育潛能研究在建立胚胎干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的根底上，探索三維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能。3〕干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的建立干細(xì)胞選擇多潛能干細(xì)胞ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞，將干細(xì)胞接種于三維支架材料上，檢測并比擬二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞細(xì)胞學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達(dá)能等。研究內(nèi)容：1〕適合不同類型干細(xì)胞培養(yǎng)的三維支架的構(gòu)建別離純化膠原蛋白，制備不同類型的三維支架材料，使其具有良好的生物相容性，適宜的硬度和孔隙結(jié)構(gòu)，建立適合不同類型干細(xì)胞培養(yǎng)的三維膠原支架材料。課題3為模式動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞自我更新與定向分化研究，其體內(nèi)的研究結(jié)果可與課題課題2體外干細(xì)胞自我更新和定向分化的研究結(jié)果相互驗(yàn)證。課題1和課題2的研究為體外研究，其分別研究三維培養(yǎng)干細(xì)胞的自我更新和定向分化調(diào)控。5〕 課題設(shè)置本工程利用細(xì)胞示蹤和成像技術(shù)，研究三維培養(yǎng)干細(xì)胞和體內(nèi)干細(xì)胞自我更新與定向分化的調(diào)控機(jī)理。工程課題負(fù)責(zé)人均為相關(guān)研究領(lǐng)域的優(yōu)秀學(xué)科帶頭人?！?〕本工程所設(shè)置的四個(gè)課題組的研究內(nèi)容相互聯(lián)系，研究成員之間已經(jīng)建立了緊密的協(xié)作關(guān)系?！?〕工程組成員在三維培養(yǎng)體系建立、干細(xì)胞定向分化研究、定量蛋白質(zhì)組學(xué)、細(xì)胞遷移與粘附、納米示蹤與成像技術(shù)等研究以及模式動(dòng)物實(shí)驗(yàn)體系建立等方面已有較好的積累〔詳見研究根底〕。4〕可行性分析： 〔1〕工程申請(qǐng)人主持了20062022年國家重大科學(xué)研究方案中“調(diào)控干細(xì)胞自我更新能力的分子網(wǎng)絡(luò)研究〞的工程，工程組對(duì)干細(xì)胞的自我更新和定向分化及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行了較為深入的研究，取得了一些重要的研究結(jié)果，豐富和開展了以O(shè)ct4和Nanog等轉(zhuǎn)錄因子為核心的干細(xì)胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?！?〕系統(tǒng)定量地分析在二維和三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞自我更新和定向分化過程中蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組的差異，找出更接近體內(nèi)環(huán)境中干細(xì)胞自我更新與分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)?！?〕活體細(xì)胞納米示蹤與成像技術(shù)作為生物醫(yī)學(xué)研究的根本手段在干細(xì)胞的自我更新與分化的體內(nèi)外研究中發(fā)揮著日益重要的作用。本工程模擬體內(nèi)干細(xì)胞自我更新和定向分化的三維環(huán)境，建立干細(xì)胞的三維培養(yǎng)分化體系，在此根底上對(duì)干細(xì)胞自我更新和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究。以磁共振影像技術(shù)作為核心技術(shù)，比照研究三維培養(yǎng)與二維培養(yǎng)干細(xì)胞在體內(nèi)維持分化與功能的差異，支撐課題3的相關(guān)研究。c. 近紅外光具有較大的組織穿透深度，利用近紅外量子點(diǎn)構(gòu)建活體熒光成像系統(tǒng)，可以在小動(dòng)物尺度對(duì)干細(xì)胞的維持和分化進(jìn)行示蹤成像。b. 采用共聚焦掃描技術(shù)實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞三維成像與示蹤?！?〕活體干細(xì)胞的標(biāo)記：將近紅外量子點(diǎn)或磁性納米粒子標(biāo)記的干細(xì)胞在體外進(jìn)行標(biāo)記，然后導(dǎo)入小鼠體內(nèi)，利用熒光信號(hào)或核磁信號(hào)對(duì)干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)的行為進(jìn)行示蹤。通過外表配體置換對(duì)納米粒子外表進(jìn)行改性和修飾。b. 采用高溫分解鐵前驅(qū)體的方法合成磁性納米粒子，通過優(yōu)化前驅(qū)體濃度、回流時(shí)間、加熱速率等反響條件，借助晶種生長法來控制粒徑的大小。具體研究途徑如下：〔1〕納米粒子的制備研究：a. 高量子效率、高生物相容性量子點(diǎn)：對(duì)目前實(shí)驗(yàn)室已有的量子點(diǎn)合成技術(shù)進(jìn)行改良，使量子點(diǎn)在光穩(wěn)定性、化學(xué)穩(wěn)定性、低毒性、熒光量子產(chǎn)率、熒光半峰全寬等各個(gè)參數(shù)上滿足后續(xù)應(yīng)用的需要?！?〕活體動(dòng)物研究：利用轉(zhuǎn)基因疾病動(dòng)物模型、干細(xì)胞移植等技術(shù)研究體內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新與定向分化?！?〕蛋白質(zhì)水平的研究：利用雙向電泳、質(zhì)譜、顯微注射、酵母雙雜交和免疫共沉淀等技術(shù)研究蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用。7〕模式動(dòng)物體內(nèi)干細(xì)胞維持分化與功能研究將從基因、蛋白質(zhì)、細(xì)胞與組織以及活體動(dòng)物水平研究體內(nèi)干細(xì)胞自我更新與分化。③非編碼RNA對(duì)干細(xì)胞自我更新、分化的影響 分別構(gòu)建正義和反義非編碼RNA重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞或肌肉干細(xì)胞，觀察超表達(dá)或Knockdown特定非編碼RNA對(duì)其生物學(xué)功能的影響。通過生物信息學(xué)分析，對(duì)非編碼RNA進(jìn)行功能分類、確認(rèn)可能的新類別非編碼RNA；分析非編碼RNA的基因組定位、尋找可能的非編碼RNA特異的上游調(diào)控元件?！?〕利用microRNA芯片進(jìn)行高通量篩選。⑦利用生物信息學(xué)和計(jì)算生物學(xué)的方法對(duì)產(chǎn)生的蛋白質(zhì)組和蛋白質(zhì)修飾數(shù)據(jù)進(jìn)行信號(hào)通路和網(wǎng)絡(luò)的分析，找出與干細(xì)胞自我更新或定向分化相關(guān)的調(diào)控通路或網(wǎng)絡(luò)。同時(shí)，附加的ETD〔Electron Transfer Dissociation〕功能是專門用來分析蛋白質(zhì)修飾的。我們將利用最先進(jìn)的帶有ETD功能的LTQOrbitrapVelos質(zhì)譜儀來分析這些樣品。同樣，對(duì)與乙酰化和泛素化，我們將分別利用已發(fā)表的免疫沉降法和親和層析法對(duì)被修飾的多肽進(jìn)行富集。讓后利用多維的液相層析和質(zhì)譜聯(lián)用的技術(shù)〔LCMS/MS), 同時(shí)對(duì)四個(gè)樣品中的蛋白進(jìn)行鑒定和定量。將這四個(gè)標(biāo)記過的樣品等量混合并進(jìn)行LCMS/MS分析，根據(jù)這四個(gè)標(biāo)記物在MS/MS圖譜上特異峰的信號(hào)強(qiáng)度，我們就可以對(duì)這個(gè)多肽在四個(gè)樣品中的相對(duì)含量進(jìn)行定量。這四個(gè)標(biāo)記物在MS/MS圖譜上所顯示的峰其質(zhì)量/電荷比分別為113，114，115，116。③利用商業(yè)化的iTraq試劑，分別標(biāo)記以上四個(gè)不同的樣品。這樣一共有四個(gè)樣品，分別標(biāo)記為三維未分化， 三維分化，二維分化，二維未分化。6〕三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新和定向分化的表觀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究〔1〕系統(tǒng)定量地分析在二維和三維培養(yǎng)條件下未分化干細(xì)胞和經(jīng)誘導(dǎo)分化細(xì)胞之間的總蛋白質(zhì)組和重要的蛋白質(zhì)修飾〔包括磷酸化、乙?；头核鼗车牟町悾瑥亩页鲈谌S培養(yǎng)條件下控制干細(xì)胞自我更新與定向分化的特異性的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。通過這些轉(zhuǎn)錄因子DNA結(jié)合位點(diǎn)來找到調(diào)節(jié)這一細(xì)胞分化過程的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)?！?〕鑒定人胚胎干細(xì)胞向心肌前體細(xì)胞分化過程中起關(guān)鍵作用的轉(zhuǎn)錄因子網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵調(diào)節(jié)通路表達(dá)KDR的細(xì)胞是心肌細(xì)胞的前提細(xì)胞。小鼠條件性敲除胚胎干細(xì)