【正文】 胞 (loxpmTORloxp) 已從歐洲條件性基因敲除小鼠工程〔European Conditional Mouse Mutagenesis program〕得到，將培育loxpmTORloxp轉(zhuǎn)基因小鼠，為條件性敲除mTOR小鼠做準(zhǔn)備。研究方案如下：別離選擇小鼠條件性 mTOR、 PTEN或Tsc1基因敲除 (mTOR活化) 的成體干細(xì)胞包括神經(jīng)和成肌干細(xì)胞，將干細(xì)胞接種于三維支架材料上，然后將TATNLSCre融合蛋白質(zhì)參加細(xì)胞培養(yǎng)液，融合蛋白質(zhì)將會被細(xì)胞攝取、入核，敲除mTOR基因或Tsc1基因，從而下調(diào)或上調(diào)mTOR通路的活性，然后檢測比擬二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞功能等。功能低下或高度活化的mTOR信號通過影響Notch信號抑制細(xì)胞分化。其中神經(jīng)細(xì)胞的研究將以Erk及mTOR信號通路為主，肌細(xì)胞的研究將以PI3K/AKT/GSK3β信號通路為主。在亞細(xì)胞水平用活體成像技術(shù)觀測參與調(diào)控細(xì)胞行為的細(xì)胞骨架(如actin或tubulin的熒光融合蛋白)及其他因子的動態(tài)變化。檢測并比擬二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞在分化過程中亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)水平的變化，用針對integrin等細(xì)胞外表標(biāo)記以及細(xì)胞骨架蛋白的特異性抗體，通過免疫熒光染色比擬二維和三維環(huán)境中干細(xì)胞及其定向分化細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、粘附特性及運(yùn)動特性。針對成肌干細(xì)胞分化產(chǎn)生的骨骼肌細(xì)胞將分別用骨骼肌標(biāo)志蛋白MHC和Caveolin3作免疫熒光染色。通過細(xì)胞形態(tài)觀察及免疫熒光染色檢測干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化后產(chǎn)生的細(xì)胞類型〔針對神經(jīng)干細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞類型將分別用神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞及寡樹突細(xì)胞標(biāo)志蛋白的特異抗體〔神經(jīng)元TuJ1及MAP2，星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP，寡樹突細(xì)胞OSP〕作免疫熒光染色, 針對人胚胎干細(xì)胞分化產(chǎn)生的心肌細(xì)胞類型將分別用α肌漿球蛋白重鏈〔αMHC〕、肌鈣蛋白C、心房利鈉肽〔ANP〕等標(biāo)志蛋白的特異抗體作免疫熒光染色,骨骼肌標(biāo)志蛋白MHC和Caveolin3〕。5〕干細(xì)胞定向分化調(diào)控機(jī)制研究〔1〕選擇成體干細(xì)胞包括神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞，將干細(xì)胞接種于三維支架材料上，檢測比擬二維和三維培養(yǎng)的神經(jīng)、心肌和成肌干細(xì)胞分化過程中的細(xì)胞學(xué)特性，包括細(xì)胞形態(tài)變化、標(biāo)志蛋白表達(dá)及細(xì)胞功能等?！?〕以生物化學(xué)方法檢測三維培養(yǎng)環(huán)境中干細(xì)胞的自我更新和分化受外界信號調(diào)控的各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的動態(tài)變化，并與通過細(xì)胞生物學(xué)手段檢測信號通路中各組分激活狀態(tài)的亞細(xì)胞分布相結(jié)合，檢測其下游靶基因的表達(dá)水平，以分析細(xì)胞中各種信號通路的整合情況，解析干細(xì)胞對于不同培養(yǎng)條件作出反響的分子根底。用針對integrin等細(xì)胞外表標(biāo)記以及細(xì)胞骨架蛋白的特異性抗體，通過免疫熒光染色比擬二維和三維環(huán)境中干細(xì)胞及其定向分化細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)、粘附特性及運(yùn)動特性。4〕干細(xì)胞自我更新調(diào)控機(jī)制研究〔1〕將干細(xì)胞接種于適宜的三維膠原支架材料，進(jìn)行自我更新和定向分化研究。〔2〕將不同干細(xì)胞接種于適宜的三維膠原支架材料，與二維培養(yǎng)體系相比擬，利用芯片技術(shù)對二者基因表達(dá)情況進(jìn)行比擬，分析在三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞的基因表達(dá)情況，利用western blot等技術(shù)對關(guān)鍵因子的蛋白表達(dá)進(jìn)行定量分析?！?〕用納米量子點熒光標(biāo)記結(jié)合活細(xì)胞成像技術(shù)記錄和追蹤經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞在三維培養(yǎng)介質(zhì)中的粘附、生長、遷移和運(yùn)動等動態(tài)行為。2〕三維膠原支架材料的修飾、優(yōu)化 在膠原支架材料的根底上，將微環(huán)境中調(diào)控干細(xì)胞自我更新和定向分化的其它細(xì)胞外基質(zhì)成份、信號分子或支持細(xì)胞等因素通過不同的方法整合到膠原支架材料上，對三維膠原支架材料進(jìn)行修飾優(yōu)化，以最大限度的模擬體內(nèi)干細(xì)胞自我更新和定向分化的環(huán)境。在體內(nèi)研究中，以線蟲和小鼠為模式動物，系統(tǒng)研究體內(nèi)干細(xì)胞的維持、分化調(diào)控機(jī)制。在體內(nèi)，干細(xì)胞的自我更新和分化是處于三維環(huán)境中，體外三維培養(yǎng)體系下細(xì)胞的行為學(xué)特性近似于體內(nèi)細(xì)胞的特性。6．在本領(lǐng)域發(fā)表論文30篇，其中影響因子5以上的15篇。5．培養(yǎng)研究生30名。分析三維培養(yǎng)干細(xì)胞與體內(nèi)干細(xì)胞維持與分化機(jī)制的異同，獲得干細(xì)胞調(diào)控的真實信息。3．通過模式動物體內(nèi)干細(xì)胞維持與定向分化研究，發(fā)現(xiàn)并鑒定與神經(jīng)干細(xì)胞的維持、分化相關(guān)的一些新基因，說明其作用機(jī)制。建立一個全國公用的干細(xì)胞三維培養(yǎng)研究的培訓(xùn)基地。五年預(yù)期目標(biāo): 1．綜合考慮多種因素，最大限度模擬體內(nèi)環(huán)境，制備出適合干細(xì)胞生長分化的三維支架材料，建立三維培養(yǎng)多能干細(xì)胞和成體干細(xì)胞的自我更新和定向分化的研究體系。工程名稱：三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新與定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)首席科學(xué)家：戴建武 中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所起止年限：依托部門：中國科學(xué)院二、預(yù)期目標(biāo)本工程的總體目標(biāo)：通過本工程的實施，建立干細(xì)胞三維培養(yǎng)和完善干細(xì)胞納米示蹤技術(shù)，解析干細(xì)胞自我更新與分化過程中遺傳與表觀遺傳的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為干細(xì)胞的應(yīng)用奠定根底。取得一批具有重大影響的科研成果，提高我國在干細(xì)胞研究領(lǐng)域的自主創(chuàng)新能力。包括標(biāo)準(zhǔn)干細(xì)胞系的鑒定、維持、分析方法、保存與復(fù)蘇、人員培訓(xùn)等根底設(shè)施和科研能力，建立三維培養(yǎng)46種不同干細(xì)胞的方法。2. 結(jié)合基因組、蛋白質(zhì)組和磷酸蛋白質(zhì)組分析結(jié)果探討三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞自我更新和定向分化的分子和細(xì)胞機(jī)制，說明在干細(xì)胞自我更新和定向分化中起關(guān)鍵調(diào)控作用的信號通路和信號網(wǎng)絡(luò)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及表觀遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。明確體外三維培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞在體內(nèi)的自我更新能力與分化潛能，并對其導(dǎo)入體內(nèi)后的有效性、平安性進(jìn)行評估。4. 建立干細(xì)胞納米示蹤與成像新技術(shù)，包括制備出高生物相容性、高量子產(chǎn)率的量子點，建立量子點標(biāo)記活細(xì)胞及亞細(xì)胞組分的方法，實現(xiàn)對三維培養(yǎng)干細(xì)胞以及活體干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，建立三維培養(yǎng)干細(xì)胞和活體干細(xì)胞的三維、非損傷性的納米示蹤與成像技術(shù)。博士后10名。三、研究方案1〕學(xué)術(shù)思路： 干細(xì)胞的自我更新和定向分化是干細(xì)胞研究中的根本問題。本工程將建立模擬體內(nèi)環(huán)境的干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系，并利用干細(xì)胞納米標(biāo)記與成像技術(shù)，研究三維培養(yǎng)干細(xì)胞自我更新和定向分化的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。2〕技術(shù)途徑： 根據(jù)研究內(nèi)容，本工程技術(shù)途徑如下圖：具體內(nèi)容如下：1） 適合不同類型干細(xì)胞培養(yǎng)的三維膠原支架的構(gòu)建別離純化膠原蛋白，制備三維膠原支架材料，檢測其生物相容性，運(yùn)用不同生產(chǎn)工藝使其具有適宜的硬度和孔隙結(jié)構(gòu)，建立適合不同類型干細(xì)胞培養(yǎng)的三維支架材料。3〕干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的建立干細(xì)胞選擇多潛能干細(xì)胞〔ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞〕和成體干細(xì)胞〔神經(jīng)干細(xì)胞、心肌干細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞〕。在亞細(xì)胞水平用活體成像技術(shù)觀測參與調(diào)控細(xì)胞行為的細(xì)胞骨架(如actin或 tubulin的熒光融合蛋白)及其他因子的動態(tài)變化。綜合利用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法對兩種培養(yǎng)體系下細(xì)胞的干細(xì)胞特性進(jìn)行比擬。別離提取細(xì)胞RNA用QPCR檢測干細(xì)胞及分化細(xì)胞標(biāo)志蛋白以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞定向分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，別離提取細(xì)胞總蛋白檢測干細(xì)胞及分化細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)水平。 〔2〕三維培養(yǎng)干細(xì)胞的發(fā)育潛能研究，在建立胚胎干細(xì)胞三維培養(yǎng)體系的根底上，探索三維培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的發(fā)育潛能，體外研究中重點探索三維胚胎干細(xì)胞向神經(jīng)、心肌等細(xì)胞分化的能力及其調(diào)控機(jī)制，體內(nèi)利用嵌合以及四倍體補(bǔ)償?shù)确椒ㄨb定三維培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育潛能及細(xì)胞多能性。其中自我更新研究將以ES細(xì)胞和iPS細(xì)胞為主，探討其以O(shè)ct4和Nanog為中心的干細(xì)胞自我更新的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；。將干細(xì)胞接種于適宜的三維膠原支架材料，進(jìn)行定向分化研究。例如肌原代成肌細(xì)胞或肌源性細(xì)胞系C2C12細(xì)胞在增殖階段的培養(yǎng)條件為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，誘導(dǎo)分化的培養(yǎng)條件為含2%馬血清的DMEM培養(yǎng)基，一般5～6天細(xì)胞可以分化成肌管。別離提取細(xì)胞RNA用QPCR檢測干細(xì)胞及分化細(xì)胞標(biāo)志蛋白以及調(diào)節(jié)干細(xì)胞分化的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，別離提取細(xì)胞總蛋白檢測干細(xì)胞及分化細(xì)胞標(biāo)志蛋白表達(dá)水平。通過與課題組四合作，用納米量子點熒光標(biāo)記結(jié)合活細(xì)胞成像技術(shù)記錄和追蹤經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化的神經(jīng)細(xì)胞在三維培養(yǎng)介質(zhì)中的粘附、生長、遷移和運(yùn)動等動態(tài)行為?！?〕運(yùn)用生化方法檢測并比擬二維和三維培養(yǎng)的干細(xì)胞分化過程中受外界信號因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)信號通路的動態(tài)變化，并與通過細(xì)胞生物學(xué)手段檢測信號通路中各組分激活狀態(tài)的亞細(xì)胞分布相結(jié)合，并檢測其下游靶基因的表達(dá)水平，分析它們各自信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑整合的特性，解析干細(xì)胞對于不同培養(yǎng)條件作出反響的分子根底。此外，我們已發(fā)現(xiàn)哺乳動物雷帕霉素靶蛋白 (mTOR) 通過STAT3p63 JaggedNotch 級聯(lián)調(diào)控細(xì)胞維持細(xì)胞增殖和分化之間的平衡。因此方案探討三維培養(yǎng)條件下干細(xì)胞定向分化的分子和細(xì)胞機(jī)制，說明在干細(xì)胞定向分化中mTOR信號傳導(dǎo)通路是否起關(guān)鍵調(diào)控作用。還可讓這些小鼠與組織特異性 CRE 表達(dá)小鼠交配，在小鼠體內(nèi)敲除mTOR、 PTEN或Tsc1，以明確mTOR在干細(xì)胞的定向分化中的作用。已有條件性Pten或Tsc1基因敲除小鼠和神經(jīng)、肌肉CRE表達(dá)小鼠。利用我們現(xiàn)有的心肌分化培養(yǎng)體系，將人胚胎干細(xì)胞在三維條件下分化成心肌細(xì)胞，并在相應(yīng)的