向內(nèi)皮細(xì)胞分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外三維構(gòu)建組織工程心臟瓣膜的實(shí)驗(yàn)研究-展示頁(yè)
2025-01-24 01:59本頁(yè)面
【正文】 CECs)作為種子細(xì)胞，去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣為支架，體外三維構(gòu)建組織工程心臟瓣膜(TEHV)。 方法 羊骨髓穿刺液，以Percoll梯度分離液離心法獲取骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，在內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化液中體外培養(yǎng)、擴(kuò)增，鑒定。 結(jié)果 MSCECs為梭形的成纖維細(xì)胞狀形態(tài),呈網(wǎng)格狀排列。)Μmol/L及(177。誘導(dǎo)分化的MSCs在支架上生長(zhǎng)良好，形成完整的細(xì)胞層。 【關(guān)鍵詞】 內(nèi)皮細(xì)胞。 間充質(zhì)干細(xì)胞。 心臟瓣膜，人工。 綿羊 心臟瓣膜置換手術(shù)已經(jīng)成為終末期心臟瓣膜疾病的主要治療手段，但目前臨床上廣泛應(yīng)用的機(jī)械瓣及生物瓣膜遠(yuǎn)未達(dá)到理想程度，而組織工程心臟瓣膜(tissue engineering heart valve,TEHV)為人工瓣膜的研制提供了一種新的思路，正成為瓣膜外科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。雖然國(guó)內(nèi)外大量研究均以人工材料為支架來源，但材料科學(xué)目前現(xiàn)狀尚不能提供一種滿意的符合TEHV要求的支架[13]。 1 材料和方法 材料 DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，% Trypsin% EDTA (美國(guó)Gibco公司), Olympus倒置相差顯微鏡(IX70型，日本Olympus公司),Ⅷ因子抗體,ΑSMA抗體,CD31抗體(美國(guó)Sigma公司),Vimentin抗體(美國(guó)Neomarker公司),一氧化氮(NO)藥盒(晶美生物工程北京有限公司),內(nèi)皮素(ET1)放射免疫藥盒(解放軍總醫(yī)院科技開發(fā)中心放射免疫所),纖維連接蛋白(Fibronectin,Fn),內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(ECGF)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)(美國(guó)Sigma公司)。 MSCECs培養(yǎng)及體外擴(kuò)增 將上述獲取的MSCs懸液以2105 cm2底面積接種于培養(yǎng)瓶中,加入內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)分化培養(yǎng)液(含10%胎牛血清的DMEM液，VEGF 10 ng/mL，ECGF 10 ng/mL，bFGF 10 ng/mL，肝素50 IU/mL),、37 ℃的CO2飽和濕度恒溫孵箱中培養(yǎng)，48 h后換液，以后每3天換液1次，當(dāng)細(xì)胞達(dá)到80%～90%% Trypsin+% EDTA消化傳代，取第2代細(xì)胞進(jìn)行鑒定，第4代以后用于研究構(gòu)建TEHV。上述細(xì)胞培養(yǎng)上清液置入70 ℃中保存，以備測(cè)定其分泌的NO及ET1水平，測(cè)定方法參照藥盒說明書操作。從第2天起，連續(xù)9 d,每天固定時(shí)間取3孔，% Trypsin+% EDTA消化后置于顯微鏡下計(jì)數(shù)，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，細(xì)胞數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線。 瓣膜支架的制備及預(yù)處理 將新鮮無菌豬主動(dòng)脈瓣(含部分升主動(dòng)脈及瓣下組織)% Trypsin+% EDTA液中于37 ℃下持續(xù)振蕩24 h，PBS液反復(fù)振蕩沖洗殘余胰酶后制備去細(xì)胞豬主動(dòng)脈瓣支架,取一支架行HE染色及彈力纖維及膠原纖維染色(VB染色)研究去細(xì)胞效果及彈力纖維，膠原纖維的完整性。本研究中支架以 50 Μg/mL的Fn溶液完全浸沒，室溫下放置1 h預(yù)處理后用于構(gòu)建TEHV。 構(gòu)建的TEHV瓣葉的組
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