【正文】 ，共 852bp，成熟肽部分為 720bp，編碼 239個氨基酸，其 DNA和氨基酸序列都與 Sugimoto等（ 2021）從 L. rubellus蚯蚓中克隆到的 FIII1和陳飛等（ 2021）則從 L. bimastus蚯蚓中克隆到 PV239同源，但是也存在一些差異。并構建了pTrxFUSPV242重組質粒，在大腸桿菌 GI724中獲得融合蛋白 TrxFUSPV242的可溶性表達，采用離子交換色譜法純化表達蛋白，融合蛋白有纖維平板溶解活性。將 FIII2 cDNA成熟肽部分克隆到甲醇酵母表達系統(tǒng)，得到了具有纖溶活性的重組纖溶酶（ 110CU(casein units)/mg），其纖溶活性高于蚯蚓粗提物 (60CU/mg)，但低于 FIII2純品(200CU/mg)。由于FIII2， FIII2或 FII的纖溶等活性最強，而且最有進行基因工程生產(chǎn)的前景，目前這些基因克隆及表達主要針對它們。 蚯蚓纖溶酶基因克隆與表達 目前 Genbank中注冊的 EFE基因有 14個，遺憾的是它們?nèi)繛?cDNA序列， EFE的全基因還沒有克隆出來，這也為將來利用基因工程高效生產(chǎn)重組 蚯蚓纖溶酶帶來了難度 。對大鼠腹膜內(nèi)注射此酶，可在血清或血漿內(nèi)檢測到 10％完整的纖溶酶分子， 5％的酶分子則具有原始 免疫學活性 ， 腹膜內(nèi)注后約 60min能檢測到最大活力 。研究發(fā)現(xiàn)，此酶能透過小腸上皮細胞進入血液 ,并在血液中保持其生物活性。 蚯蚓纖溶酶口服有效的機理 Mihara等（ 1990）發(fā)現(xiàn)蚯蚓纖溶酶通過口 服可以激活內(nèi)在的溶栓作用。第四軍醫(yī)大學王克為教授等人從鮮蚯蚓中提取制備抗腫瘤新藥 ——— 地龍膠囊（ 912），該藥具有強烈的抑制腫瘤細胞生長的作用，是一個良好的輻射增效劑和化學增效劑。除了直接抗腫瘤的作用，蚯蚓提取物對放療、化療和熱療有 增效作用，可明顯提高全量放療的完全緩解率。臨床檢驗結果表明治療組優(yōu)球蛋白溶解時間明顯縮短 ,纖微蛋白含量減少 ,全血粘度、血漿粘度及血小板聚集功能顯著降低 ,說明博 洛克具有改善腦梗塞患者血液流變和增強纖溶活性的作用。并于治療前后進行神經(jīng)功能缺損評分并觀察血液流變學及纖溶、凝血指標的變化。龐式琪等（ 1992）采用雙盲隨機法觀察了博洛克對 453例腦梗塞患者的溶栓效果 ,其中治療組 303例 ,對照組 150例。目前已有多種蚓激酶制劑應用于臨床，主要為各種膠囊制劑，如普恩復、百奧、博洛克、溶栓膠囊等，多用在心腦血管疾病方面，主要包括缺血性腦病、急性心肌梗死和冠心病等，都取得顯著療效。已知細胞外基質對腫瘤的生長很重要， EFE對裸鼠移植瘤的生長抑制作用可能與其纖溶酶活性有關。胡云龍等（ 2021）曾用 EFE在小鼠肝癌Ｈ22和肉瘤Ｓ 180模型進行藥效學研究，結果 EFE在 100mg/kg可明顯抑制腫瘤生長，并增強小鼠免疫功能。蚓激酶對血液流變的調(diào)節(jié)作用為高粘血癥的臨床治療開拓了研究思路。張祖 珣 等（ 1992）觀察了蚓激酶靜脈給藥 4ｈ血液流變學指標的變化。上述實驗證實蚓激酶能抑制腦缺血后血栓形成，減輕腦組織損傷，提示蚓激酶可作為腦血管疾病的防治藥物。內(nèi)皮素和ＴＸＢ 2增加是判斷腦組織缺血損傷程度的客觀指標。 對腦缺血的保護作用 腦血管血栓形成是腦缺血 的主要原因。 抗凝作用 在纖溶過程中伴有纖維蛋白原的降低及血纖維蛋白降解產(chǎn)物（ FDP）的增加，纖維蛋白原的減少可阻止血栓繼續(xù)形成，而 FDP本身就具有抗凝作用，因此，抗凝作用是纖溶作用的一個重要伴隨現(xiàn)象。 楊樹東等（ 1997）應用蚯蚓提取物Ｆ 2組分兔耳靜脈給藥 ,以纖維蛋白平板溶解面積為活性單位 ,給藥劑量為 105ｍｍ 2/ｋｇ ,結果發(fā)現(xiàn)給藥后 1ｈ優(yōu)球蛋白溶解活性升高 ,2ｈ達峰值 , 。蚯蚓纖溶酶纖溶作用的機制是：不僅能直接水解纖維蛋白和纖維蛋白原，還能激活纖維蛋白溶酶原，后者間接水解纖維蛋白，從而 起到溶解血栓和抑制血栓形成的作用。 蚯蚓纖溶酶 藥效學研究 有關蚯蚓纖溶酶的藥效學研究的國外文獻不多，而國內(nèi)有較充分的文獻資料 ,表明蚓激酶具有多方面的藥理作用。 Wang等（ 2021a）對 EFEa晶體結構進行改良后，發(fā)現(xiàn) EFEa具有多底物結合位點，當一個位點能量不足時，其它位點進行補償而使底物與酶順利結合；與其它絲氨酸相比， EFEa的 N端有兩個 loop發(fā)生了結構改變，使底物更容易與酶相互作用，從而使 EFEa不僅能作用于彈性蛋白特異 底物，還能水解胰凝乳蛋白酶特異底物和胰蛋白酶特異底物。 酶的 S2亞位點一部分被 Tyr99的大側鏈所閉塞。 Tang等 (2021)以硫酸銨為沉淀劑，用 Hangingdrop vapourdiffusion得到了能用于衍射分析的EFEa(FII)單晶，晶體屬于斜方晶系，每個不對稱的單位由三個分子組成 ,大小 。經(jīng)過我國科學家的努力，在世界上第一次揭示了蚯蚓纖溶酶的空間結構，進一步闡明了該酶的作用機制（ Tang等， 2021）。 Ogino等（ 1999）組裝了一個特殊的循環(huán)裝置，將纖溶酶固定，讓纖維蛋白液體與纖溶酶反應，每 24小時更換一次纖維蛋白液，結果發(fā)現(xiàn)每次反應固定化的纖溶酶都能保持完全的纖溶活性，而且這種纖溶活性至少能持續(xù)一個月以上。 圖 3：蚯蚓纖溶酶溶栓作用機理（以百奧蚓激酶為例） 纖溶酶的作用底物非常多，除了能水解纖維蛋白和纖維蛋白溶酶原外，還能水解彈性蛋白、血紅蛋白 、酪蛋白，膠原以及白蛋白，甚至具有酯酶活性，能水解很多酯類的酯骨架，從而可以用于降解一些難降解的蛋白和生物塑膠（ Nakajima等， 2021）。 纖溶酶組分還具有自溶現(xiàn)象。纖溶酶還能激活纖維蛋白溶酶原（ plasminogen）產(chǎn)生纖維蛋白溶酶（ plasmin） ,作用類似于尿激酶 (urokinase)和組織纖溶酶原激活物（ tPA），可以將纖維蛋白溶酶原水解為 6－ 7個片段，其中 1520％是具有催化活性的纖維蛋白溶酶，該 酶可以水解纖維蛋白 （ Zhao等， 2021） 。 纖溶酶最主要的酶學特性是纖溶活性 ，不僅能直接水解纖維蛋白原和纖維蛋白，還能激活纖維蛋白溶酶原從而間接起到纖溶作用，這兩點正是蚯蚓纖溶酶能起纖溶作用和抗凝血作用的酶學基礎。由此可見，蚯蚓纖溶酶是一組非常穩(wěn)定的絲氨酸蛋白酶。大多數(shù)纖溶酶都具有熱穩(wěn)定性，能在 60℃以下保持酶活性， 55℃時達到最高活性，但在 80℃加熱 30分鐘纖溶酶活性就完成喪失；纖溶酶還能在 pH212的較大范圍內(nèi)保持活性，而最佳纖 溶反應的 pH值范圍較寬，多數(shù)在 7～ 10之間； 氨基酸組成中酸性氨基酸含量較多 ,堿性氨基酸含量較低； 纖溶酶在室溫條件下能長期保存，在一定溶液內(nèi)室溫保存 5年以上，纖溶酶能保持80％的纖溶活性；纖溶酶還不受丙酮、丙烷、甲苯和乙烷等有機溶劑以及一些去污劑的影響（ Nakajima等， 2021）。但它們又有一些共同特點， 綜合起來 , 蚯蚓纖溶酶是一組存在于蚯蚓體內(nèi)的絲氨酸蛋白水解酶，包括 6－ 7種組分，相對分子質量為 20210～ 30000， pI在 3～ 5之間，每種組分都具有纖溶活性或纖溶酶原激活活性，其中組分 FIII2和 FIII1酶學活性最高，而 FII次之， FI0， FI1和 FI2活性最低，因此 FIII1， FIII2和 FII的酶學特性、空間結構、基因克隆以及表達等方面研究得更透徹，而且 FIII1， FIII2和 FII也是進行基因工程生產(chǎn)的重點。 圖 1： Nakajima等（ 1993）分離的六種 EFE成分，af分 別代表 FⅢ 1和 FⅢ 2 FII， FI2， FI1和 FI0 圖 2 Wang等（ 2021）分離的七種 EFE成分， 2－ 8分別代表 EFEa,b,c,d,e,f,g 2021年 Cho等（ a）也從 Lumbricus rubellus蚯蚓中分離純化出了六種纖溶酶組分 F1F6，酪蛋白水解活性 F2 F1 F5 F6 F3 F4，而纖維蛋白原水解活性則是 F6 F2 F5 F3 F1 F4，其中 F1F4受 PMSF抑制，而 F5F6則受其它一些抑制劑抑制，而且 F2F4的 N端氨基酸序列相同，而 F5F6也是相同的。單獨的大亞基只有較弱的纖溶活性 ,而單獨的小亞基沒有任何可見的纖溶活性 ， 很可能小亞基是一個調(diào)節(jié)亞基 ， 大亞基是催化亞基。 1998年趙曉瑜等利用親和層析技術從 Lumbricus rubellus蚯蚓中分離出至少九種纖溶酶組分，經(jīng)分析，這些纖溶酶是一組非均一的糖蛋白，含糖量為 5％ ，以中性己糖為主，這與 Mihara等 (1991)結果不一致。 1998年克羅地亞的 Hrzenjak等報道從 Eisenia fetida蚓的勻漿中分離到一組含有糖脂蛋白的纖溶活性成分 ,并命名為Ｇ－ 90。 1993年，韓國 Ryu等用 Mihara的方法從 Lumbricus rubellus蚯蚓中 提取出由六個成分組成的具有強纖溶活性的蚓激酶成分 ,此六種酶有不同的纖溶活性。通過以上步驟可獲得較高純度的多個組分的蚯蚓纖溶酶，目前臨床應用的蚯蚓纖溶酶大多采用這種方法和改進方法分離純化的。 隨后國內(nèi)外多個實驗室也開展了蚓激酶的純化研究，分離純化技術日趨成熟。在 pH2～ 11和最高不超過 60℃的條件下穩(wěn)定。各個酶分子對應的 PI值分別為 ， ， ， ， 。 1991年， Mihara等再次報道其從 L. rubellus中提取出一組具有強纖溶活性的蚓激酶成分，分子量為 20～ 30kD， PI值為 3 4, 此酶具有熱穩(wěn)定性和在廣泛的 pH范圍內(nèi)保持活性，其對提取的蚓激酶純化后獲得生化性質不同的 3個片段，此 3個片段可進一步分離 ,片段 I可分離為 FI0， FI1和 FI2，片段Ⅱ不能再分離