【正文】 核生物中表達(dá)，其產(chǎn)物往往是沒有活性的。 化學(xué)合成的最大優(yōu)點(diǎn)是可以合成一些分離較困難的基因。 在體外，可以合成一系列長(zhǎng)約幾百ｂｐ的寡聚核苷酸鏈，然后按照基因的順序?qū)⑦@些短的核苷酸鏈連接起來(lái)。Klenow片段 ： DNA pol I 用枯草桿菌蛋白酶水解成兩個(gè)片段，小片段（ 36KD）具有 5’ 3’ 核酸外切酶活性，大片段（ 76KD）稱為 Klenow片段，具有 DNA鏈聚合及 3’ 5’核酸外切酶的活性。五、 DNA pol I及 Klenow片段? 該酶常用于制備放射性比度比活體標(biāo)記高得多的ＤＮＡ探針，探針的制備方法是采用所謂的缺口平移（ nick translation）法制備的。 四、反轉(zhuǎn)錄酶（ reverse transcriptase）? 這類酶來(lái)自于反轉(zhuǎn)錄病毒，它可以ＲＮＡ為模板，催化合成ＤＮＡ。它可催化ＤＮＡ中磷酸二脂鍵的形成，從而使兩個(gè)片段以共價(jià)鍵的形式結(jié)合起來(lái)。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是克隆位點(diǎn)具有限制酶的酶切位點(diǎn)。銜接物是一種人工合成的小分子 DNA，約 10~20個(gè)核苷酸，其結(jié)構(gòu)特征是含有多種限制性核酸內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)的回文結(jié)構(gòu)。末端轉(zhuǎn)移酶常用于在平頭ＤＮＡ上合成一段寡聚核苷酸，從而形成粘性末端。例： EcoR I: 來(lái)自于 Escheria coli RY13的第一個(gè)限制酶。其它字母：大寫或小寫，表示所來(lái)自的微生物的菌株號(hào)。限制性核酸內(nèi)切酶的命名原則：第一個(gè)字母：大寫，表示所來(lái)自的微生物的屬名的第一個(gè)字母。同尾酶 （ isocaudamer）： 指來(lái)源不同、識(shí)別靶序列不同但產(chǎn)生相同的粘性末端的核酸內(nèi)切酶。同裂酶進(jìn)行同樣的切割，產(chǎn)生同樣的末端。Ⅲ 型酶 ：這類酶可識(shí)別特定順序，并在這一順序的 3’端24~26bp處切開ＤＮＡ，所以它的切割位點(diǎn)也是沒有特異性的。?識(shí)別位點(diǎn)是一個(gè)回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)，并且切割位點(diǎn)也在這一回文對(duì)稱結(jié)構(gòu)上。這類酶有特異的識(shí)別位點(diǎn)但沒有特異的切割位點(diǎn)，所以在基因工程中應(yīng)用不大。限制性內(nèi)切酶本來(lái)是微生物細(xì)胞中用于專門水解外源ＤＮＡ的一類酶，其功能是避免外源ＤＮＡ的干擾或噬菌體的感染，是細(xì)胞中的一種防御機(jī)制。? 遺傳工程的基本操作程序大致包括：目的基因的制備，載體的選擇，體外ＤＮＡ重組，重組ＤＮＡ引入受體細(xì)胞，克隆轉(zhuǎn)化子的篩選，重組ＤＮＡ的檢測(cè)等。所以基因工程（ gene engineering）也稱為遺傳工程（ geic engineering）、基因操作（ gene manipulation）、ＤＮＡ重組技術(shù)（ rebination DNA techniques）。然后通過載體把重組ＤＮＡ分子引入受體細(xì)胞，使外源ＤＮＡ在受體細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)。獲得雜種細(xì)胞及其再生植株后，即可進(jìn)行 物種間細(xì)胞核、染色體以及細(xì)胞器 的轉(zhuǎn)移。l 植物細(xì)胞融合由于細(xì)胞壁的存在而受到極大的限制。穆特 獲得克隆羊所采用的乳腺細(xì)胞核可以獲得物種間雜種生物個(gè)體。當(dāng)然動(dòng)物細(xì)胞融合都局限于獲得雜種細(xì)胞及其無(wú)性細(xì)胞系。(三 )、細(xì)胞、原生質(zhì)體融合l 采用細(xì)胞、原生質(zhì)體融合產(chǎn)生雜種細(xì)胞，通過誘導(dǎo)再生獲得雜種個(gè)體 (雙二倍體 )，可 避免有性雜交障礙 。l 在這些組織、器官中：– 細(xì)胞壁的存在會(huì)增加操作的難度；– 產(chǎn)生細(xì)胞嵌合體現(xiàn)象，難以篩選 轉(zhuǎn)化子 。l 對(duì) 動(dòng)物 而言，克隆羊 “多利 ”的誕生表明：動(dòng)物細(xì)胞 (包括人體細(xì)胞 )再生成為個(gè)體都是可能，其技術(shù)實(shí)現(xiàn)需要的僅僅是時(shí)間。l 對(duì) 植物 而言，細(xì)胞和原生質(zhì)體再生技術(shù)已經(jīng)比較成熟。*三、細(xì)胞工程l 細(xì)胞工程的主要技術(shù)和研究領(lǐng)域包括：– 細(xì)胞、原生質(zhì)體的分離、培養(yǎng)；– 細(xì)胞、原生質(zhì)體植株再生 ；– 體細(xì)胞 無(wú)性系變異 的誘導(dǎo)、篩選與應(yīng)用；– 以細(xì)胞、原生質(zhì)體作為 基因工程受體 ；– 細(xì)胞、原生質(zhì)體 融合、 雜種細(xì)胞篩選、鑒定與應(yīng)用 。l 作為一個(gè)綜合性的技術(shù)群體系， 廣義的遺傳工程 包含許多相關(guān)的組成部分，其主要的部分有三個(gè)：– 1. 染色體工程；– 2. 細(xì)胞工程；– 3. 基因工程。l 遺傳工程的理論與技術(shù)基礎(chǔ)主要來(lái)自于：1. 分子遺傳學(xué)的理論；2. 生物化學(xué)及分子生物學(xué)的成就；3. 細(xì)胞生物學(xué)理論和技術(shù)。一、 遺傳工程概述(一 )、 遺傳工程的基礎(chǔ)l 人類對(duì)自然改造的能力取決于對(duì)自然規(guī)律的認(rèn)識(shí)水平。l 訖今為止，動(dòng)、植物育種的絕大部分成就都是以經(jīng)典遺傳、細(xì)胞遺傳和數(shù)量遺傳理論為基礎(chǔ)所取得的。– 改善動(dòng)、植物和微生物的遺傳特性 —— 按照人類的意愿，創(chuàng)造、培育各種生物的新類型、新品種的 人工進(jìn)化 過程 (育種學(xué) )。第六節(jié) 遺傳工程一、 遺傳工程概述*二、 染色體工程*三、 細(xì)胞工程四、 基因工程一、 遺傳工程概述l 遺傳研究要闡明遺傳與變異的現(xiàn)象和基本規(guī)律，探索遺傳與變異的原因及其物質(zhì)基礎(chǔ)。二、 基因突變的類型3. 從 DNA堿基序列改變的多少：– 單點(diǎn)突變 (替換 )；與經(jīng)典遺傳學(xué)的點(diǎn)突變 point mutation比較 .– 多點(diǎn)突變 (移碼 )。二、 基因突變的類型1. 根據(jù)突變所引起的表型改變分為：– 形態(tài)突變型；– 生化突變型；– 致死突變型；– 條件致死突變型。第五節(jié) 基因突變的分子機(jī)制一、 locus與 site二、 基因突變的類型三、 DNA的防護(hù)機(jī)制四、 DNA修復(fù)與突變的產(chǎn)生五、化學(xué)因素誘變的分子機(jī)制一、 locus與 sitel 經(jīng)典遺傳學(xué)認(rèn)為：– 基因是染色體上的一個(gè)點(diǎn)，稱位點(diǎn) (site)。– 后來(lái)發(fā)現(xiàn)某些 DNA序列可以在染色體上轉(zhuǎn)變位置。4. 跳躍基因 (jumping gene)l 又稱為轉(zhuǎn)座子 (transposon)、轉(zhuǎn)座因子、轉(zhuǎn)位因子 (transposable element)。– 外顯子：參加蛋白質(zhì)編碼的 DNA片段；– 內(nèi)含子：不參加蛋白質(zhì)編碼的 DNA片段。3. 斷裂基因或隔裂基因l 生物遺傳和早期分子遺傳認(rèn)為基因是一個(gè)連續(xù)的、完整的結(jié)構(gòu)。l 2. 重疊基因：– 同一段 DNA序列，由于閱讀框架 (轉(zhuǎn)錄范圍 )不同，同時(shí)成為兩個(gè)或兩個(gè)以上基因的組成部分。重復(fù)基因往往是生命活動(dòng)中最基本、最重要的功能相關(guān)的基因。操縱基因是阻遏蛋白、激活蛋白與 DNA結(jié)合的部位。– 如啟動(dòng)基因、操縱基因。– 轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 RNA不翻譯，如編碼 tRNA、 rRNA。– 如結(jié)構(gòu)蛋白、酶等 結(jié)構(gòu)基因 和產(chǎn)生調(diào)節(jié)蛋白的 調(diào)節(jié)基因 。l 基因可以包含多個(gè)功能單位 (順反子 )。l 基因由重組子、突變子序列構(gòu)成的。l Benzer提出 “一個(gè)順反子一條多肽鏈 ”。l 有些基因具有一個(gè)順反子，有些基因具有多個(gè)順反子。rII的兩個(gè)順反子l 經(jīng)典遺傳學(xué)意義上的一個(gè)基因(rII區(qū)段 )實(shí)際上有兩個(gè)順反子 (功能單位 )。rII順反測(cè)驗(yàn)l rII區(qū)段突變的性質(zhì)：– rII突變具有共同性狀，按經(jīng)典遺傳學(xué)理論， rII區(qū)段為一個(gè)基因 ；– 如果基因是最小的功能單位，它也是一個(gè)順反子。l 這種測(cè)驗(yàn)稱為 互補(bǔ)測(cè)驗(yàn) ，也稱為 順反測(cè)驗(yàn) (cistrans test)。1. 雙突變雜合體的互補(bǔ)作用l 假定有兩個(gè)獨(dú)立起源的隱性突變，具有類似的表型，如何判定是屬于 同一基因 (功能單位 )的突變還是分別屬于 兩個(gè)基因 (功能單位 )的突變呢？l 在二倍體生物中，可以建立 雙突變雜合體 。但以后研究顯示：突變子和重組子都是一個(gè)核苷酸對(duì)或者堿基對(duì) (bp)。 Benzer提出用 突變子(muton)來(lái)描述基因突變的最小單位。B品系雙重感染的結(jié)果3. 最小的結(jié)構(gòu)單位l 重組值檢測(cè)精度可達(dá)十萬(wàn)分之一，但實(shí)際結(jié)果不會(huì)低于 %；可推斷基因內(nèi)存在最小重組單位，本澤爾將最小重組單位定義為 重組子 (recon)。*雙重感染法繪制 rII區(qū)段連鎖圖l 操作方法：– 用兩種 rII突變型雙重感染 B品系，收集溶菌液；– 分別接種到 B品系、 K(λ)品系菌苔上；– 考察兩個(gè)品系菌苔上的噬菌斑數(shù)目，就可以計(jì)算兩個(gè)突變位點(diǎn)間的重組值；– 繪制連鎖遺傳圖。l 結(jié)論：– 這些基因并不是所謂的擬等位基因，而就是 rII區(qū)段突變形成的 復(fù)等位基因 。– Benzer先后分離到 400多個(gè)不同的 rII突變。雙重感染試驗(yàn)野生型的產(chǎn)生與基因內(nèi)重組l 結(jié)果分析：– 回復(fù)突變的頻率很小，不會(huì)產(chǎn)生如此高頻率的野生型噬菌體 (斑 )；所以野生型只能由重組產(chǎn)生。試驗(yàn)方法與結(jié)果l 試驗(yàn)方法：– 最初得到 8個(gè)不同的 rⅡ 突變型品系， 8個(gè)突變基因均定位于 T4DNA的一個(gè)區(qū)段內(nèi) (rII區(qū)段 )；– 將 8種突變型兩兩組合混和感染 E. Coli B菌株 (雙重感染 , double infection)；– 從混和培養(yǎng)物中提取噬菌體顆粒感染 E. coli K(λ)。– T4突變品系按表型可分為： rI、 rII、 rIII三類。T4突變型 (rII)遺傳研究l Seymour Benzer(1955)用 E. Coli烈性噬菌體 T4突變型遺傳研究證明：擬等位基因的說(shuō)法是不正確的。l 通用性的另外情況：第四節(jié) 基因的概念與發(fā)展一、經(jīng)典遺傳學(xué)中基因的概念二、 生化遺傳和早期分子遺傳學(xué)　　對(duì)基因概念的發(fā)展三、 基因的微細(xì)結(jié)構(gòu)與性質(zhì)四、 現(xiàn)代分子遺傳學(xué)關(guān)于基因的概念二、 生化遺傳學(xué)對(duì)基因概念的發(fā)展l 生化遺傳及早期分子遺傳研究在兩個(gè)重要方面發(fā)展了基因的概念：– 基因是 DNA分子上帶有遺傳信息的特定核苷酸序列區(qū)段，并且在染色體上 位置固定 、 序列連續(xù) ；遺傳信息就存在于核苷酸 (堿基 )序列中。三、遺傳密碼及其特性l 遺傳密碼的基本特性：– 三聯(lián)性；– 非重疊性；– 連續(xù)性；– 簡(jiǎn)并性；– 有序性；– 通用性。l RNA的自我復(fù)制。l 最初由 Crick提出，并經(jīng)過了多次修正。3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性*四、 RNA的分子結(jié)構(gòu)*五、 DNA的復(fù)制1. DNA復(fù)制的起點(diǎn) (單起始點(diǎn)與多起始點(diǎn) )；2. 復(fù)制的方向 (單向與雙向 )；3. 復(fù)制的拓?fù)鋵W(xué)；4. 鏈的延伸 (半不連續(xù) )；5. 復(fù)制的終止；6. 單鏈環(huán)狀 DNA的復(fù)制；7. 復(fù)制的忠實(shí)性 (準(zhǔn)確性 )；8. 復(fù)制的酶學(xué)；9. 復(fù)制的調(diào)控。– 基因和多肽成線性對(duì)應(yīng)的一個(gè)可能的理由： DNA核苷酸順序規(guī)定該基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸順序；DNA中的 遺傳信息就是堿基序列 ；并存在某種遺傳密碼 (geic code)，將核苷酸序列譯成蛋白質(zhì)氨基酸順序。 Waston和Crick在 1953年就指出： DNA可以按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行半保留復(fù)制。l 為此 Waston， Crick和 Wilkins于 1962年獲得了諾貝爾生理學(xué)及醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。3. 沃生、克里克研究小組l 主要基于 Chargaff、 Pauling和 Wilkins等三個(gè)方研究成果， Waston和 Crick于 1953年提出了他們的第三個(gè) DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型。3. 沃生、克里克研究小組Waston、 Crick(19511953)：l 研究手段非常簡(jiǎn)單：用紙板等做磷酸、核糖和堿基模型，拼湊 DNA分子的三維結(jié)構(gòu)。l 注： 1954年鮑林因研究物質(zhì)聚合力而獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。– 提出 DNA分子三鏈螺旋結(jié)構(gòu)模型：引入 多鏈、螺旋和氫鏈 等概念。l 也由此激發(fā)了科學(xué)家從事核酸結(jié)構(gòu)研究的興趣，當(dāng)時(shí)進(jìn)行 DNA結(jié)構(gòu)研究的科學(xué)家很多，最重要有：1. 鮑林研究小組l 主要工作：– 鮑林 (Pauling)等 1951年 (提出蛋白質(zhì) α螺旋模型后 )開始研究 DNA分子結(jié)構(gòu)。三、 DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)*(一 )、 DNA分子結(jié)構(gòu)的研究1. 鮑林研究小組2. 威爾金斯、富蘭克林研究小組3. 沃生、克里克研究小組(二 )、 DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型1. DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點(diǎn)2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型的意義3. DNA分子構(gòu)型的多態(tài)性*(一 )、 DNA分子結(jié)構(gòu)的研究l 在 “四核苷酸結(jié)構(gòu) ”理論的誤導(dǎo)下，人們普遍認(rèn)為核酸的組成、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，可能不具有重要功能，一度忽略了對(duì)核酸的研究。l 以后的研究表明：堿基序列正是核酸生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，是遺傳信息的內(nèi)在形式。(二 )、 查伽夫定則及其意義l 19461950年根據(jù)紙層析、離子交換層析和紫外分光光度試驗(yàn)結(jié)果提出查伽夫定則：– 四種堿基的數(shù)量不是等量的；– 同一物種 DNA堿基組成不變，而物種間則有很大不同；– 嘌呤堿基總量與嘧啶堿基的總量 (克分子總量 )相等(A+G=T+C)，且 A=T、 G=C。但同時(shí)認(rèn)為：– 核酸多聚體是由 “四核苷酸結(jié)構(gòu) ”重復(fù)形成；– 每個(gè)四核苷酸結(jié)構(gòu)包含四種堿基各一個(gè)；– 所以事實(shí)上認(rèn)為在任何 DNA中，四種堿基是 等量 的， DNA是四核苷酸結(jié)構(gòu)的 簡(jiǎn)單重復(fù) 。(一 )、 “四核苷酸 ”假說(shuō)l (1930)提出 “四核苷酸 ”假說(shuō)，認(rèn)為：– 核苷酸 是核酸的基本組成單位；– 核酸是 “磷酸 — 核糖 (堿基 )— 磷酸 ”的 核苷多聚體 。二、 核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)l 關(guān)于堿基的種類、分子式、核苷酸的種類、結(jié)構(gòu)等內(nèi)容