【正文】 突變體初篩 → 復篩 → 搖瓶發(fā)酵試驗 → 選出突變體 → 生產試驗或重復誘變處理（詳情見教材） 一、突變與育種 ? 誘變育種的原則 ： ? 挑選優(yōu)良的出發(fā)菌株 ? 處理單孢子 (或單細胞 )懸液 ? 選擇簡便有效、最適劑量的誘變劑 一、突變與育種 ? 出發(fā)菌株是用于育種的原始菌株。 ? 發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產部門使用的高產菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產性能的。過程十分緩慢， “ 守株待兔 ” 。 一、突變與育種 ? （一）、自發(fā)突變與育種： ? 生產選育：富于實際經驗并且善于細致觀察的人們在日常生產過程中，發(fā)現自然突變，選育優(yōu)良菌株。 ? 關鍵之一：選育從遺傳角度解除了微生物正常代謝機制的突變株。 半知菌的準性生殖示意圖 準性生殖和有性生殖的比較 項 目 準 性 生 殖 有 性 生 殖 參與接合的親本細胞 獨立生活的異核體階段 接合后雙倍體的細胞形態(tài) 雙倍體變?yōu)閱伪扼w的途徑 接合發(fā)生的幾率 形態(tài)相同的體細胞 有 與單倍體基本相同 通過有絲分裂 偶然發(fā)現 , 幾率低 形態(tài)或生理上有分化的性細胞 無 與單倍體明顯不同 通過減數分裂 正常出現 , 幾率高 第三節(jié) 微生物育種 ? 目前，微生物發(fā)酵已由野生型菌株發(fā)酵向代謝調控發(fā)酵轉移。 雙倍體雜合子性狀極不穩(wěn)定 ,在其進行有絲分裂過程中 ,其中極少數核中的染色體會發(fā)生交換和單倍體化 ,從而形成了極個別具有新性狀的單倍體雜合子。某些理化因素如樟腦蒸汽、紫外線或高溫等的處理 ,可以提高頻率。 ? 核配：異核體中的雙核偶爾可以發(fā)生核融合 ,產生雙倍體雜合子核。 ? 形成異核體：聯結后 ,原有的兩個單倍體核集中到同一個細胞中 ,形成雙相異核體。雙倍體細胞和單倍體細胞有很大不同 ,易于識別。用蒸餾水洗下子囊，經機械法 (加硅藻土和石蠟油，在勻漿管中研磨 )或酶法 (如蝸牛酶 )破環(huán)子囊，離心，獲得子囊孢子，涂布平板，培養(yǎng)，得到單倍體菌落?？墒雇簧锏膬蓚€不同來源的體細胞經融合后，不通過減數分裂而導致低頻率的基因重組。能產生有性孢子者，均可采用有性雜交。因此 ，Hfr與 F接合的結果重組頻率雖高 ， 但卻很少出現 F+的菌株，大多數情況下，仍是 F 。由于種種原因 ， 這種線狀染色體在轉移過程中經常會發(fā)生斷裂 ， 越在前端的基因 ， 進入的機會就越多 ， 在 F中出現重組子的時間就越早 ，頻率也高。 通過質粒來傳遞供體基因的方式，稱為 F質粒轉導、 F因子轉導、性導、 F質粒媒介轉導。 ? F因子傳遞 “ 滾環(huán)模型 ” ：① F因子的一條 DNA單鏈在特定位置上發(fā)生斷裂； ② 斷裂的單鏈逐漸解開 ， 同時以留下的另一條環(huán)狀單鏈作模板 ， 通過模板的旋轉 ， 將解開的單鏈通過性菌毛推入 F中 ，同時 在供體細胞內 ， 重新合成一條新的環(huán)狀單鏈 ， 取代解開的單鏈 ； ③ F細胞中 ， 外來 DNA單鏈上也合成一條互補的新 DNA鏈 ， 恢復成環(huán)狀雙鏈 F因子 ，F變成了 F+。該菌株稱為初生 F′菌株。 ? Hfr(高頻重組 )菌株： F因子被整合在 DNA上。 （一）原核微生物基因重組 ? 大腸桿菌的 4種類型： ? F (“雌性” )菌株：沒有 F因子 ,表面不具性菌毛。 ? 分子量 5 107 ， DNA含量 2%， 1～ 4個／細胞。 研究細菌接合方法的基本原理 （一）原核微生物基因重組 ? 大腸桿菌 F因子 (即致育因子或性質粒 )： ? 獨立于染色體外的小型的環(huán)狀 DNA， 一般呈超螺旋狀態(tài)，具有自主的與染色體進行同步復制和轉移到其他細胞中去的能力。 ? 放線菌研究得最多的是鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬等 ， 尤以天藍色鏈霉菌最為詳細。 （一）原核微生物基因重組 ? 接合：通過供體菌和受體菌完整細胞間直接接觸而傳遞大段 DNA的過程。鴨沙門氏菌（ ε15噬菌體）－細胞表面多糖結構變化。 ? 區(qū)別： 溫和噬菌體不攜帶供體菌基因； 噬菌體完整，沒有缺陷。 （一）原核微生物基因重組 ? 溶原轉變：溫和噬菌體感染宿主使之溶原化，使宿主獲得除免疫性以外的新性狀的現象。兩種噬菌體同時整合在一個受體菌核染色體組上 ， 受體菌成為雙重溶原菌。 低頻轉導 (LFT)裂解物的形成 （一）原核微生物基因重組 ? 高頻轉導 (HFT)： 用高感染復數的 HFT裂解物感染其它 受體菌，高頻率地轉化為 +轉導子的方式。該溶原菌因誘導而發(fā)生裂解時，有極少數 (～ 105)的前噬菌體發(fā)生不正常切離，將插入位點兩側之一的少數宿主基因，連接到噬菌體DNA上，噬菌體也將相應的一段 DNA遺留在宿主的染色體組上，通過衣殼的“誤包”，形成一種特殊的噬菌體 —（部分）缺陷噬菌體。 （一）原核微生物基因重組 ? 低頻轉導 (LFT)： 用 低感染復數的 LFT裂解物感染宿主 ， 獲得極少量局限轉導子的方式。 ? ①只能轉導供體菌的個別特定基因 (一般為噬菌體整合位點兩側的基因 )；②該特定基因由部分缺陷（與完全缺陷相對而言）的噬菌體攜帶。所以，只能在選擇性培養(yǎng)基平板上形成一個微小菌落（即其中只有一個細胞是轉導子）。 ? 受體菌進行分裂時，只有一個子細胞獲得這段DNA，另一子細胞僅獲得供體基因的產物 —酶，在表型上出現供體菌的某一特征。導入的供體 DNA片段可與受體染色體組上的同源區(qū)段配對，再通過雙交換而重組到受體菌染色體上，形成遺傳性穩(wěn)定的轉導子。供體菌裂解時，如把少量裂解物與大量的受體菌群相混，這種特殊噬菌體將外源 DNA片段導入受體菌。 （一）原核微生物基因重組 ? 完全轉導：鼠傷寒沙門氏菌野生型菌株作供體菌，營養(yǎng)缺陷型為受體菌， P22 噬菌體作為轉導媒介。 （一）原核微生物基因重組 ? A、 普遍性轉導：噬菌體 本身 DNA沒有包進去，形成缺陷型，同時 誤包供體菌中的任何基因 (包括質粒 )， 使受體菌實現各種性狀的轉導。 ? 1952年在鼠傷寒沙門氏桿菌中發(fā)現。 （一）原核微生物基因重組 ? 轉導與溶源轉變： ? 通過 缺陷或溫和噬菌體的媒介 ，把供體細胞的 DNA片段攜帶到受體細胞中，從而使后者獲得了前者部分遺傳性狀的現象。 轉化中單鏈外基因組片段與雙鏈內基因組間的交換與整合過程示意圖 （一）原核微生物基因重組 ? 轉染：抽提噬菌體或其他病毒的 DNA(或RNA) ，感染感受態(tài)的宿主細胞，產生正常的噬菌體或病毒后代的現象 。低濃度溶菌酶處理 ，提高細胞壁通透性 ， 可提高轉化頻率； （一）原核微生物基因重組 ? ④轉化：進入的單鏈與受體菌染色體組上的同源區(qū)段配對，接著受體染色體組的相應單鏈片段被切除，并被外來的單鏈 DNA所交換和取代，形成雜合 DNA區(qū)段 (它們間的 DNA順序不一定互補，故可呈雜合狀態(tài) )； ? ⑤復制：染色體組復制，雜合區(qū)段分離成兩個，其中之一類似供體菌，另一類似受體菌。 轉化過程示意圖 G＋ 肺炎雙球菌的轉化過程 ? ①吸附： 雙鏈 DNA片段與感受態(tài)（受體菌最易接受外源 DNA片段并實現轉化的生理狀態(tài) ）受體菌細胞表面的特定位點 (主要在新形成細胞壁的赤道區(qū) )結合 ， 膽堿可促進這一過程； ? ②酶解： 吸附的 DNA被核酸內切酶分解 ， 形成平均分子量 4～ 5 106的 DNA片段； ? ③進入： 一條單鏈被膜上另一種核酸酶切除 ， 另一條單鏈耗能后逐步進入細胞。 ? 轉化后的受體菌，稱為轉化子。 環(huán)出效應設想圖：復制時， 上鏈標記 B處發(fā)生“環(huán)出”，只有 A及 C獲得復制，從而發(fā)生自發(fā)突變。堿基對發(fā)生自發(fā)突變的幾率約為 108～109。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現自發(fā)突變株，可能也是同樣原因。如果在加入該酶的同時又加入酶抑制劑 KCN， 則又可提高突變率。 （三）基因突變 機制 ? B、 自身代謝產物的誘變：過氧化氫是普遍存在于微生物體內的一種代謝產物。 （三）基因突變 機制 ? 自發(fā)（沒有人工參與所發(fā)生）突變機制： ? A、 背景輻射和環(huán)境因素的誘變：不少“自發(fā)突變”實質上是一些原因不詳的低劑量誘變因素長期綜合誘變導致。 （三）基因突變 機制 ? 注意：許多理化誘變劑的誘變作用都不是單一功能的。 ? 染色體結構變化，分染色體內畸變和染色體間畸變。由移碼突變所產生的突變株，稱為移碼突變株 。 ? 對休止細胞、游離噬菌體粒子或離體DNA分子不起作用 。它們可與一個或幾個核苷酸發(fā)生化學反應，引起 DNA復制時堿 （三）基因突變 機制 ? 間接置換誘變：通過活細胞的代謝活動使堿基類似物摻入到 DNA分子中引起誘變。 堿基的置換（實－轉換、虛－顛換） （三）基因突變 機制 ? 直接置換誘變：直接與核酸堿基發(fā)生化學反應的誘變劑，不論在機體內或在離體條件下均有作用。分為轉換（嘧啶或嘌呤同類更換）、顛換（嘧啶或嘌呤異類更換） 。 （三）基因突變 機制 ? 誘變機制：顯著提高突變頻率的理化因子，稱為誘變劑。 ? 可逆性 由原始野生型基因變異為突變型基因的過程稱為正向突變，反之稱為回復突變或回變 。 （二）基因突變特點 ? 誘變性 誘變劑可提高自變頻率 10～105倍。某一基因的突變，不影響其他基因的突變率。 ? 稀有性 自變頻率低且穩(wěn)定 ，多為 106～ 109 。 （二）基因突變特點 ? 不對應性 突變性狀與原因無直接對應關系。 ? 非選擇性突變：沒有選擇性標記，只有一些性狀的數量差別。 （一）基因突變類型 ? 按分離： ? 選擇性突變：具有選擇性標記，可通過某種環(huán)境條件使它們得到優(yōu)勢生長 ,從而取代原始菌株。例如， 37℃ 下正常生長，不能在 42℃ 下生長等。 （一）基因突變類型 ? 致死突變型 基因突變導致個體死亡。 ? B、 抗性突變型：能抵抗有害理化因素，分抗藥性、抗紫外線或抗噬菌體等。分營養(yǎng)缺陷型、抗性突變型和抗原突變型。 ? 按表型特征 ： ? 形態(tài)突變型：細胞或菌落形態(tài)改變。 一、基因突變 ? （一）、類型 ? （二）、特點 ? （三）、 機制 （一）基因突變類型 ? 按內部結構： ? 基因突變 （ 點突變 ）： 一對或少數幾對堿基發(fā)生改變。 ? 基因重組指把兩個不同性狀個體內的遺傳基因轉移到一起，經過重新組合，形成新遺傳型個體。 ? 僅在假單胞菌屬中發(fā)現。 四、原核生物的質粒 ? （六）、降解性質粒：可編碼降解復雜物質的酶，利用一般細菌難以分解的物質作碳源。 四、原核生物的質粒 ? （五）、巨大質粒： 200～300 106Da， 比一般質粒大幾十倍至幾百倍。