【正文】 復(fù)習(xí)思考題 ? 證明核酸是遺傳變異物質(zhì)基礎(chǔ)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)有幾個(gè) ?請(qǐng)?jiān)敿?xì)說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的過(guò)程。 ? 法國(guó)“里昂巴斯德研究所” (IPL)。 ? 工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (CICC) 輕工業(yè)部食品發(fā)酵工業(yè)科學(xué)研究所，南京 (ID)，真菌；衛(wèi)生部藥品生物制品檢定所，北京(NICPBP)， 細(xì)菌；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所，北京 (IV)， 病毒。 三、菌種保藏 ? 石蠟油封藏法 向培養(yǎng)好的菌種斜面上加入滅菌石蠟油，高出斜面 1cm， 然后蠟封管口，立放在冰箱中。 三、菌種保藏 ? （一）、菌種保藏原理：選擇典型菌種的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體 (如分生孢子、芽孢等 )；創(chuàng)造有利休眠的環(huán)境條件，如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑等。純化可以用劃線分離、稀釋分離、單孢子分離等方法，所得單菌落需作生產(chǎn)性狀測(cè)試，以保證性能優(yōu)良。 ? 菌種保藏方式 溫度影響自發(fā)突變及細(xì)胞活力。缺陷型基因發(fā)生頻率很低的回復(fù)突變，由于具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，在傳代過(guò)程中，數(shù)量比例上升很快，就斜面菌種而言退化細(xì)胞還只是少數(shù)，但發(fā)酵過(guò)程中這些少數(shù)菌的存在會(huì)使退化性狀表現(xiàn)強(qiáng)烈，成為事實(shí)上退化菌種。 ? 菌種退化是一個(gè)逐漸發(fā)展的過(guò)程，指細(xì)胞群體的變化，而不是指單個(gè)細(xì)胞的變化。 ? 1981年起 ， 在枯草桿菌或大腸桿菌中克隆和表達(dá)了來(lái)自枯草桿菌、淀粉液化芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌等菌種的 α－ 淀粉酶基因 ，比野生株 最高的可達(dá) 30倍。 ? 理想情況，重組載體進(jìn)入受體細(xì)胞 ,通過(guò)自主復(fù)制而大量擴(kuò)增 ,使受體細(xì)胞表達(dá)出供體基因所提供的部分遺傳性狀 ,受體細(xì)胞就成為“工程菌”。植物細(xì)胞主要是 TI質(zhì)粒 ? 載體必須具備 :①有自我復(fù)制能力；②能在受體細(xì)胞內(nèi)大量增殖，有較高的復(fù)制率；③最好只有一個(gè)限制性內(nèi)切酶的切口，使目的基因能固定地整合到載體 DNA的一定位置上；④載體上必須有一種選擇性遺傳標(biāo)記，如具有四環(huán)素、氨芐青霉素等的抗性基因，以便及時(shí)把極少數(shù)“工程菌”選擇出來(lái)。需要人為定向篩選融合子。壁剝離不徹底，有助于再生。濃度 ～ 0. 8mol/L。 ? ④ 提高酶解溫度，酶解反應(yīng)加快；酶蛋白逐漸變性失活。特別是對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)菌來(lái)說(shuō)，用誘變方法獲得標(biāo)記，往往對(duì)該菌株的生產(chǎn)性能影響甚大，應(yīng)盡可能采用該菌株自身已帶的遺傳標(biāo)記。 ? 復(fù)合處理的方法：兩種或多種誘變劑的先后使用；同一種誘變劑的重復(fù)使用；兩種或多種誘變劑的同時(shí)使用。最常用的烷化劑有 N甲基N′硝基 N亞硝基胍 (NTG)、 甲基磺酸乙酯(EMS) 、 甲基亞硝基脲 (NMU)、 硫酸二乙酯(DES)、 氮芥、乙烯亞胺和環(huán)氧乙烷等。 ? ①選用 單倍體純種，排除異核體和異質(zhì)體影響； ? ② 采用優(yōu)良性狀菌株； ? ③ 選擇對(duì)誘變劑敏感的菌株，或改變菌株的遺傳型，提高菌株敏感性； ? ④ 高產(chǎn)突變往往需要逐步累積，有必要多選一些經(jīng)過(guò)誘變的菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行多步育種，確保高產(chǎn)菌株的獲得。 ? 方法：主要是誘變、雜交、遺傳工程等。如構(gòu)巢曲霉、米曲霉核融合頻率為 105～ 107。 （二）真核微生物基因重組 ? 有性雜交 — ? 釀酒酵母：將甲、乙兩個(gè)雙倍體親本，分別接種到產(chǎn)孢培養(yǎng)基 (醋酸鈉培養(yǎng)基等 )斜面上，使其產(chǎn)生子囊，減數(shù)分裂，形成 4個(gè)單倍體子囊孢子。 （一）原核微生物基因重組 ? Hfr與 F ： 接合時(shí) ， Hfr染色體在 F因子處發(fā)生斷裂 ， 由環(huán)狀變成線狀， F因子位于最末端。 ? F+ (“雄性” )菌株：細(xì)胞中存在游離 F因子 ,表面具性菌毛，數(shù)目與因子數(shù)相同。 ? 細(xì)菌以生活在腸道內(nèi)的大腸桿菌、沙門氏菌 、志賀氏菌 、 賽氏桿菌 、 弧菌 、 固氮菌、克氏桿菌和假單胞桿菌等屬的一些種最為常見(jiàn)。當(dāng)雙重溶原菌被紫外線等誘導(dǎo)時(shí) ，正常 λ噬菌體（助體或輔助噬菌體）的基因可補(bǔ)償 λdgal 所缺失的部分基因功能 ， 兩種噬菌體同時(shí)獲得復(fù)制的機(jī)會(huì)；裂解物含有等量 λ和 λdgal 粒子 ， 稱 HFT裂解物。 ? 分為低頻轉(zhuǎn)導(dǎo)和高頻轉(zhuǎn)導(dǎo)。 （一）原核微生物基因重組 ? 1個(gè)完全缺陷的假噬菌體只能感染 1個(gè)受體細(xì)胞，受體細(xì)胞不會(huì)發(fā)生溶原化和裂解。獲得新遺傳性狀的受體細(xì)胞，稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)子。來(lái)自供體的 DNA片段稱為轉(zhuǎn)化因子，一般是雙鏈 DNA片段。說(shuō)明過(guò)氧化氫很可能是“自發(fā)突變”中的一種內(nèi)源性誘變劑。前者只涉及一條染色體，后者非同源染色體間的易位。種類很多，例如亞硝酸、羥胺和各種烷化劑 (硫酸二乙酯、甲基磺酸乙脂、 N甲基 N′硝基 N亞硝基胍、 N甲基 N亞硝基脲、乙烯亞胺、環(huán)氧乙酸、氮芥等 )。 ? 穩(wěn)定性 遺傳結(jié)構(gòu)突變，新性狀穩(wěn)定遺傳。例如菌落大小、顏色深淺及代謝產(chǎn)物量的多少等。 ? C、 抗原突變型 細(xì)胞成分尤其是細(xì)胞表面成分(細(xì)胞壁、莢膜、鞭毛 )的細(xì)微改變而引起抗原性變化。屬于分子水平雜交。外源基因可借DNA重組技術(shù)插入到 Ti質(zhì)粒中，進(jìn)一步整合到植物染色體上，改變遺傳性，培育優(yōu)良品種。含其他抗生素的抗性基因，例如抗青霉素 、 安比西林 、 氯霉素 、鏈霉素 、 卡那霉素和磺胺等基因。 ? 遇吖啶類染料、絲裂霉素 C、 紫外線、利福平、重金屬離子或高溫等因素 ， 可使子代細(xì)胞中質(zhì)粒消失 。 1984， 天藍(lán)色鏈霉菌等，發(fā)現(xiàn)線形質(zhì)粒。 三、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式 ? 原核生物的基因調(diào)控系統(tǒng)是由操縱子（啟動(dòng)基因、操縱基因、結(jié)構(gòu)基因）和調(diào)節(jié)基因組成。 ? RNA裸露，缺乏蛋白質(zhì)衣殼保護(hù)，感染頻率低于正常 TMV粒子的感染頻率。 ? S菌轉(zhuǎn)移給 R菌的，不是某一遺傳性狀(如莢膜多糖 )本身，而是以 DNA為物質(zhì)基礎(chǔ)的遺傳信息。 （一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) ? 1944年，美 Avery等進(jìn)行了離體條件轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。重新降溫至 25℃ ，所有細(xì)胞產(chǎn)色素能力又可以恢復(fù)。 ? 具有某遺傳型的生物只有在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境條件下，通過(guò)自身的代謝和發(fā)育，才能將它具體化，即產(chǎn)生表型。 ? 變異：指生物體遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)或數(shù)量的改變，即遺傳型的改變。 一、基本概念 ? （四）、飾變 ： 不涉及遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)改變而只發(fā)生在轉(zhuǎn)錄、翻譯水平上的表型變化。 ? 細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)：熱死 S菌在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，不生長(zhǎng)；活 R菌在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，長(zhǎng)出 R菌；熱死 S菌和活 R菌在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，長(zhǎng)出大量 R菌和 106S菌。加脫氧核糖核酸酶 (DNase)可阻止轉(zhuǎn)化作用 （一）轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn) ? 上述結(jié)果說(shuō)明： ? S菌 DNA將 R型轉(zhuǎn)化為 S型。 ? 用含 32PDNA(核心 )的噬菌體作感染實(shí)驗(yàn) 用含 35S蛋白質(zhì) (外殼 )的噬菌體作感染實(shí)驗(yàn) （三）植物病毒的重建實(shí)驗(yàn)： ? 1956， 美 ， TMV（ RNA）和 HRV（ 與 TMV近緣的霍氏車前花葉病毒） 。 43=64＞ 20－ 23，出現(xiàn)一種以上密碼子編碼同一種氨基酸的現(xiàn)象。 ? 啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄：阻遏蛋白從操縱基因上解除；依賴于DNA的 RNA多聚酶附著在啟動(dòng)基因上，通過(guò)操縱基因，沿著結(jié)構(gòu)基因移動(dòng)，轉(zhuǎn)錄 mRNA。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? 質(zhì)粒復(fù)制與核染色體同步 ， 稱“嚴(yán)緊型復(fù)制控制”，細(xì)胞一般含 1～ 2個(gè)質(zhì)粒 ； 不同步 ， 稱“松弛型復(fù)制控制” ， 一般含 10～ 15個(gè)或更多。其一稱 RTF質(zhì)粒 (抗性轉(zhuǎn)移因子 )，含有調(diào)節(jié) DNA復(fù)制和拷貝數(shù)的基因及轉(zhuǎn)移基因，有時(shí)還有四環(huán)素抗性基因 。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? （四）、 Ti質(zhì)粒、誘癌質(zhì)粒：大型，長(zhǎng) 200kb。 ? 僅在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。分營(yíng)養(yǎng)缺陷型、抗性突變型和抗原突變型。 （一）基因突變類型 ? 按分離： ? 選擇性突變：具有選擇性標(biāo)記，可通過(guò)某種環(huán)境條件使它們得到優(yōu)勢(shì)生長(zhǎng) ,從而取代原始菌株。某一基因的突變，不影響其他基因的突變率。分為轉(zhuǎn)換（嘧啶或嘌呤同類更換）、顛換（嘧啶或嘌呤異類更換） 。由移碼突變所產(chǎn)生的突變株，稱為移碼突變株 。 （三）基因突變 機(jī)制 ? B、 自身代謝產(chǎn)物的誘變：過(guò)氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。 環(huán)出效應(yīng)設(shè)想圖：復(fù)制時(shí)， 上鏈標(biāo)記 B處發(fā)生“環(huán)出”，只有 A及 C獲得復(fù)制，從而發(fā)生自發(fā)突變。 轉(zhuǎn)化中單鏈外基因組片段與雙鏈內(nèi)基因組間的交換與整合過(guò)程示意圖 （一）原核微生物基因重組 ? 轉(zhuǎn)染：抽提噬菌體或其他病毒的 DNA(或RNA) ，感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒后代的現(xiàn)象 。 （一）原核微生物基因重組 ? 完全轉(zhuǎn)導(dǎo)：鼠傷寒沙門氏菌野生型菌株作供體菌，營(yíng)養(yǎng)缺陷型為受體菌， P22 噬菌體作為轉(zhuǎn)導(dǎo)媒介。所以，只能在選擇性培養(yǎng)基平板上形成一個(gè)微小菌落（即其中只有一個(gè)細(xì)胞是轉(zhuǎn)導(dǎo)子）。 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) (LFT)裂解物的形成 （一）原核微生物基因重組 ? 高頻轉(zhuǎn)導(dǎo) (HFT)： 用高感染復(fù)數(shù)的 HFT裂解物感染其它 受體菌，高頻率地轉(zhuǎn)化為 +轉(zhuǎn)導(dǎo)子的方式。鴨沙門氏菌（ ε15噬菌體）－細(xì)胞表面多糖結(jié)構(gòu)變化。 ? 分子量 5 107 ， DNA含量 2%， 1～ 4個(gè)／細(xì)胞。 ? F因子傳遞 “ 滾環(huán)模型 ” ：① F因子的一條 DNA單鏈在特定位置上發(fā)生斷裂； ② 斷裂的單鏈逐漸解開 ， 同時(shí)以留下的另一條環(huán)狀單鏈作模板 ， 通過(guò)模板的旋轉(zhuǎn) ， 將解開的單鏈通過(guò)性菌毛推入 F中 ，同時(shí) 在供體細(xì)胞內(nèi) ， 重新合成一條新的環(huán)狀單鏈 ， 取代解開的單鏈 ； ③ F細(xì)胞中 ， 外來(lái) DNA單鏈上也合成一條互補(bǔ)的新 DNA鏈 ， 恢復(fù)成環(huán)狀雙鏈 F因子 ，F(xiàn)變成了 F+。能產(chǎn)生有性孢子者，均可采用有性雜交。 ? 形成異核體：聯(lián)結(jié)后 ,原有的兩個(gè)單倍體核集中到同一個(gè)細(xì)胞中 ,形成雙相異核體。 半知菌的準(zhǔn)性生殖示意圖 準(zhǔn)性生殖和有性生殖的比較 項(xiàng) 目 準(zhǔn) 性 生 殖 有 性 生 殖 參與接合的親本細(xì)胞 獨(dú)立生活的異核體階段 接合后雙倍體的細(xì)胞形態(tài) 雙倍體變?yōu)閱伪扼w的途徑 接合發(fā)生的幾率 形態(tài)相同的體細(xì)胞 有 與單倍體基本相同 通過(guò)有絲分裂 偶然發(fā)現(xiàn) , 幾率低 形態(tài)或生理上有分化的性細(xì)胞 無(wú) 與單倍體明顯不同 通過(guò)減數(shù)分裂 正常出現(xiàn) , 幾率高 第三節(jié) 微生物育種 ? 目前，微生物發(fā)酵已由野生型菌株發(fā)酵向代謝調(diào)控發(fā)酵轉(zhuǎn)移。 ? 發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過(guò)誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能的。 ? 誘變霉菌或放線菌稍加萌發(fā)的孢子；芽孢桿菌的芽孢 (只有一個(gè)核質(zhì)體 )；細(xì)菌對(duì)數(shù)期誘變處理效果較好。 ? 正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，負(fù)變則相反；經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株，更容易出現(xiàn)負(fù)變。已知融合頻率較高時(shí)，為了減少標(biāo)記對(duì)正常代謝的干擾，可以僅有一個(gè)標(biāo)記。細(xì)菌采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，放線菌采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期到平衡期之間的轉(zhuǎn)換期最為合適。過(guò)短，原生質(zhì)體形成不完全；過(guò)長(zhǎng)，隨著