【正文】 ? 保藏措施 :當(dāng)菌種保藏單位收到合適菌種時，先將原種制成若干液氮保藏管作為保藏菌種；然后再制一批冷凍干燥保藏菌種作為分發(fā)用。使生長代謝暫時停止，不易發(fā)生變異，可長時間保存，一般為 5～ 10年，最多可達(dá) 15年。 二、菌種復(fù)壯 ? （一）、純種分離：從退化菌種的細(xì)胞群體中分離出保持原有典型性狀的單細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)，恢復(fù)原菌株的典型性狀。如陳舊的培養(yǎng)物中可能積累對微生物有毒害作用的物質(zhì)而提高突變率，溫度上升也有利于突變，某些營養(yǎng)成分的不足可促進(jìn)野生型回復(fù)突變株的生長優(yōu)勢。 第五節(jié) 菌種保藏 ? 微生物受外界環(huán)境的影響會經(jīng)常地發(fā)生小機(jī)率的變異，這種變異可能造成菌種生產(chǎn)性狀的劣化或自身死亡。 一、基因工程的基本操作 ? （四）、重組載體引入受體細(xì)胞： ? 微生物 、 動物或植物細(xì)胞。兩者均可在選擇培養(yǎng)基上生長，一般前者較穩(wěn)定，后者不穩(wěn)定，會分離成親本類型，有的甚至以異核狀態(tài)移接幾代。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? ⑤ 酶解時間應(yīng)適宜。目的基因不一定與標(biāo)記基因連鎖。這是初次分離的菌株經(jīng)傳代后很快出現(xiàn)生產(chǎn)性狀 “ 衰退 ” 的主要原因。如對雙倍體雜合子用紫外線、 γ 射線等進(jìn)行處理 ,就會促進(jìn)染色體斷裂、畸變或?qū)е氯旧w在兩個子細(xì)胞中分配不均 ,因而有可能產(chǎn)生各種不同性狀組合的單倍體雜合子。 F因子的存在方式及其相互關(guān)系 （二）真核微生物基因重組 ? 有性雜交：指性細(xì)胞間的接合和隨之發(fā)生染色體重組 ， 并產(chǎn)生新遺傳型后代的一種方式。還帶有一些對細(xì)胞生命活動關(guān)系較小的基因。當(dāng)它感染宿主并整合在宿主基因組上時，可使宿主細(xì)胞成為一個局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子，而不是一個溶原菌，不具有對相同溫和噬菌體的免疫性。 ? 分為完全普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（完全轉(zhuǎn)導(dǎo)）和流產(chǎn)普遍轉(zhuǎn)導(dǎo)（流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)）。 （三）基因突變 機(jī)制 ? D、 環(huán)出效應(yīng)： DNA復(fù)制中，如果其中某一單鏈上偶而產(chǎn)生一個小環(huán)，則會因其上的基因越過復(fù)制而發(fā)生遺傳缺失，從而造成自發(fā)突變。 （三）基因突變 機(jī)制 ? B、 移碼突變：誘變劑使 DNA分子中一個或少數(shù)幾個核苷酸增添 (插入 )或缺失，從而使該部位后面的全部遺傳密碼發(fā)生轉(zhuǎn)錄和翻譯錯誤的一類突變。 ? 獨(dú)立性 某一群體中，可發(fā)生抗青霉素的突變型，也可發(fā)生抗鏈霉素或任何其他藥物的抗藥性。 ? 生化突變型 代謝途徑發(fā)生變異而形態(tài)沒有明顯變化。 ? 攜帶 Col因子的菌株，由于質(zhì)粒本身編碼一種免疫蛋白，從而對大腸桿菌素有免疫作用，不受其傷害。 ? 質(zhì)粒消失不會造成菌體死亡 。 三、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式 ? （六）、密碼子水平：決定 3個核苷酸順序（ AA） 的片斷，遺傳的信息單位。 自 SIII抽提的 DNA與活 R菌系細(xì)菌混合，少數(shù) R細(xì)胞轉(zhuǎn)化成 S細(xì)胞。 ? 變異特點(diǎn)：在群體中以極低的幾率 (一般為 105～ 1010)出現(xiàn)；性狀變化的幅度大；變化后的新性狀是穩(wěn)定和可遺傳的。 ? 代謝 遺傳型 +環(huán)境條件 表型 發(fā)育 一、基本概念 ? （二）、表型 ： 某一生物體所具有的一切外表特征及內(nèi)在特性的總和，是遺傳型在合適環(huán)境下的具體體現(xiàn)。 ? 從活 S菌分離提純各種細(xì)胞成分 —— DNA，RNA， 蛋白質(zhì)，莢膜多糖等。 TMV重建實(shí)驗(yàn)示意圖 (粗線 箭頭表示遺傳信息的去向 ) 二、證明核酸是遺傳變異 物質(zhì)的經(jīng)典實(shí)驗(yàn) ? 通過上述三個經(jīng)典實(shí)驗(yàn)，確信無疑地得出結(jié)論 ， 只有核酸才是貯存遺傳信息的真正物質(zhì)。 ? 某些質(zhì)粒具有與核染色體整合和脫離的功能 ，如 F因子 ， 稱“附加體” 。 一種可通過接合而轉(zhuǎn)移的 R因子的形成 (IS因子是轉(zhuǎn)座因子，可使 RTF質(zhì)粒和 r決定質(zhì)粒結(jié)合 ) 四、原核生物的質(zhì)粒 ? （三）、 Col因子、產(chǎn)大腸桿菌素因子。 一、基因突變 ? （一）、類型 ? （二）、特點(diǎn) ? （三）、 機(jī)制 （一）基因突變類型 ? 按內(nèi)部結(jié)構(gòu)： ? 基因突變 （ 點(diǎn)突變 ）： 一對或少數(shù)幾對堿基發(fā)生改變。 （二）基因突變特點(diǎn) ? 不對應(yīng)性 突變性狀與原因無直接對應(yīng)關(guān)系。它們可與一個或幾個核苷酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，引起 DNA復(fù)制時堿 （三）基因突變 機(jī)制 ? 間接置換誘變：通過活細(xì)胞的代謝活動使堿基類似物摻入到 DNA分子中引起誘變。在許多微生物的陳舊培養(yǎng)物中易出現(xiàn)自發(fā)突變株，可能也是同樣原因。 ? 1952年在鼠傷寒沙門氏桿菌中發(fā)現(xiàn)。 （一）原核微生物基因重組 ? 低頻轉(zhuǎn)導(dǎo) (LFT)： 用 低感染復(fù)數(shù)的 LFT裂解物感染宿主 ， 獲得極少量局限轉(zhuǎn)導(dǎo)子的方式。 ? 放線菌研究得最多的是鏈霉菌屬、諾卡氏菌屬等 ， 尤以天藍(lán)色鏈霉菌最為詳細(xì)。由于種種原因 ， 這種線狀染色體在轉(zhuǎn)移過程中經(jīng)常會發(fā)生斷裂 ， 越在前端的基因 ， 進(jìn)入的機(jī)會就越多 ， 在 F中出現(xiàn)重組子的時間就越早 ，頻率也高。某些理化因素如樟腦蒸汽、紫外線或高溫等的處理 ,可以提高頻率。 一、突變與育種 ? 誘變育種必須使用均勻狀態(tài)的單細(xì)胞懸液。 誘變因子的復(fù)合處理及其協(xié)同效應(yīng) 單獨(dú)處理 復(fù)合處理 菌種 誘變劑 突變率 (%) 誘變劑 突變率 (%) 土曲霉 紫外線 X 射線 1 X 射線 + 紫外線 土曲霉 氮芥 (%) 紫外線 不明顯 氮芥 + 紫外線 鏈霉菌 紫外線 γ 射線 紫外線 + γ 射線 金色鏈霉菌 (2U 84) 二乙烯三胺 硫酸二乙酯 紫外線 二乙稀三胺 + 紫外線 硫酸二乙酯 + 紫外線 灰色鏈霉菌 (JIC 1) 紫外線 紫外線 + 可見光照射 1 次 紫外線 + 可見光照射 6 次 二、原生質(zhì)體融合育種 ? （一）基本原理 ： 將兩個親株細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以剝除，在高滲環(huán)境中釋放出只有原生質(zhì)膜包被著的球狀原生質(zhì)體；將兩個親株的原生質(zhì)體在高滲條件下混合，由聚乙二醇(PEG)等助融，使細(xì)胞質(zhì)融合；通過兩套基因組之間的接觸、交換，發(fā)生基因組的遺傳重組，在再生細(xì)胞中獲得重組體。最適溫度是兩種效應(yīng)的共同結(jié)果。菌種本身的再生特性、原生質(zhì)體制備條件、再生培養(yǎng)基成分及再生培養(yǎng)條件等影響再生。 一、基因工程的基本操作 ? （三）、目的基因與載體 DNA的體外重組：采用限制性內(nèi)切酶處理目的基因與載體 DNA， 獲得互補(bǔ)粘性末端或人工合成粘性末端。目前美國已用基因工程菌生產(chǎn)。 一、菌種退化及其防治 ? 非基因突變 。利用生產(chǎn)菌株的遺傳標(biāo)記，如營養(yǎng)缺陷型及抗性等，進(jìn)行生長譜平板檢查、藥物濃縮或抗性平板生長等也是純化的方法。該法既可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又能使菌種與空氣隔絕。 ? 西德“柯赫研究所” (RKI)。 三、菌種的保藏 ? 根據(jù)世界菌種保藏聯(lián)合會調(diào)查 ， 55個國家的菌種保藏機(jī)構(gòu)共有 352個 ，許多大學(xué)及研究所都有自己的保藏機(jī)構(gòu)。 三、菌種保藏 ? 農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (ACCC) 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院土壤肥料研究所，北京 (ISF)。 ? （三）、淘汰衰退個體：例如對 “ 5406” 放線菌的分生孢子 ， 采用 10～ 30℃ 5～ 7天 ， 死亡率達(dá)80%， 在抗低溫的存活個體中 ， 留下了未退化的健壯個體。誘變處理后進(jìn)行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證保藏菌種純粹，不再發(fā)生分離回復(fù)。如產(chǎn)孢能力喪失、發(fā)酵液產(chǎn)物組成改變、主產(chǎn)物減少和副產(chǎn)物增加等。 ? 以重組質(zhì)粒作載體 ,用轉(zhuǎn)化方法； 以病毒DNA作重組載體 ,用感染方法。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 篩選實(shí)用性菌株 融合子類型是各種各樣的，存在性能和產(chǎn)量不同的情況。細(xì)菌中多用蔗糖、丁二酸鈉、NaCl等，酵母菌中多用山梨醇、甘露醇等，霉菌中多用 KCl和 NaCl等。最好選擇對菌株生產(chǎn)性能沒有影響的標(biāo)記。如紫外線、 X射線、 γ射線和快中子等；烷化劑、堿基類似物和吖啶類化合物。 ? 關(guān)鍵之一：選育從遺傳角度解除了微生物正常代謝機(jī)制的突變株。可使同一生物的兩個不同來源的體細(xì)胞經(jīng)融合后，不通過減數(shù)分裂而導(dǎo)致低頻率的基因重組。 （一）原核微生物基因重組 ? 大腸桿菌的 4種類型： ? F (“雌性” )菌株：沒有 F因子 ,表面不具性菌毛。兩種噬菌體同時整合在一個受體菌核染色體組上 ， 受體菌成為雙重溶原菌。供體菌裂解時，如把少量裂解物與大量的受體菌群相混，這種特殊噬菌體將外源 DNA片段導(dǎo)入受體菌。 ? 轉(zhuǎn)化后的受體菌，稱為轉(zhuǎn)化子。 ? 染色體結(jié)構(gòu)變化，分染色體內(nèi)畸變和染色體間畸變。 （二）基因突變特點(diǎn) ? 誘變性 誘變劑可提高自變頻率 10～105倍。 ? B、 抗性突變型：能抵抗有害理化因素，分抗藥性、抗紫外線或抗噬菌體等。 ? 植物遺傳工程研究的重要載體。 ? 少數(shù)質(zhì)?？梢栽诓煌觊g發(fā)生轉(zhuǎn)移 ， 如 F、 R等。 ? （七）、核苷酸、堿基水平：最低突變單位或交換單位（ A、 G、 T、 C）。微量純DNA(6 108g)， 仍有轉(zhuǎn)化能力。 ? 例如，粘質(zhì)沙雷氏菌 25℃ 培養(yǎng)，產(chǎn)生深紅色靈桿菌素，把菌落染成鮮血似的 (因此過去稱它為“神靈色桿菌”或“靈桿菌” )； 37℃ 時，群體中所有個體都不產(chǎn)色素。 微生物與遺傳學(xué)研究： ? 個體結(jié)構(gòu)簡單；營養(yǎng)體多為單倍體；易于在成分簡單的合成培養(yǎng)基上生長繁殖；繁殖速度快；易于累積不同的最終代謝產(chǎn)物及中間代謝物；菌落形態(tài)特征的可見性與多樣性；環(huán)境條件對各個體作用具有直接性和均一性；易于形成營養(yǎng)缺陷型；一般都有相應(yīng)的病毒；存在多種處于進(jìn)化過程中的原始有性生殖方式等。 ? S型菌無細(xì)胞抽提液試驗(yàn)：活 R菌加 S菌的無細(xì)胞抽提液，在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，長出大量的 R菌和少量的 S菌。 ? 將 TMV放在一定濃度的苯酚溶液中振蕩 ,使蛋白質(zhì)外殼與 RNA分離。 三、遺傳物質(zhì)在細(xì)胞中的存在方式 ? 真核生物的基因：沒有操縱子結(jié)構(gòu)，存在不編碼序列和重復(fù)序列，轉(zhuǎn)錄與翻譯有空間分隔，基因之間被許多無編碼功能的內(nèi)含子阻隔。11 106Da。 第二節(jié) 基因突變與基因重組 ? 突變指遺傳物質(zhì)的核苷酸順序突然發(fā)生了穩(wěn)定的可遺傳的變化。如營養(yǎng)缺陷型或抗性突變型等。 ? 某一種誘變劑，可同時引起轉(zhuǎn)換與顛換，也可只具一個功能。對脈孢菌有誘變作用，加入過氧化氫酶可降低這種作用。 ? 與轉(zhuǎn)化不同之處：病毒或噬菌體并非遺傳基因的供體菌，中間也不發(fā)生任何遺傳因子的交換或整合，最后也不產(chǎn)生具有雜種性質(zhì)的轉(zhuǎn)化子。 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)示意圖 （一）原核微生物基因重組 ? B、 局限轉(zhuǎn)導(dǎo)：通過部分缺陷的溫和噬菌體把供體菌的少數(shù)特定基因攜帶到受體菌中，并獲得表達(dá)的轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)象。紅霉素