【正文】 鏈霉菌（ P4噬菌體）－紅霉素生物合成及形成氣生菌絲等能力。 （一）原核微生物基因重組 F′F 初生 F′菌株與 F 菌株接合，使之成為次生 F′菌株，含有質(zhì)?；蚝腿舾稍瓕?Hfr菌株的遺傳性狀。異核體能獨立生活。提高產(chǎn)量、改進質(zhì)量、擴大品種和簡化生產(chǎn)工藝等，是使用最廣泛的育種手段之一。 ? 過去用紫外線作誘變劑，常采用殺菌率為 99或%的劑量，近年來傾向于采用殺菌率為70%～ 75%，甚至更低 (30%～ 70%)的劑量，特別是對于經(jīng)多次誘變后的高產(chǎn)菌株更是如此。 ? ③ 酶濃度過低，不利于原生質(zhì)體形成；酶濃度增加，形成率增大；超過一定范圍，形成率提高不明顯，并且導(dǎo)致再生率降低。 二、原生質(zhì)體融合育種 ? 再生 酶解去壁后的原生質(zhì)體應(yīng)能重建細(xì)胞壁，恢復(fù)細(xì)胞完整形態(tài)，生長、分裂。 一、基因工程的基本操作 ? （二）、選擇載體：原核受體細(xì)胞的載體，主要是細(xì)菌質(zhì)粒 (松弛型 )和 λ噬菌體。 二、基因工程在微生物方面的應(yīng)用 ? 改良工業(yè)酶生產(chǎn)菌株 ： 蛋白酶、木糖異構(gòu)酶、纖維素酶、葡萄糖淀粉酶以及凝乳酶等均進行了研究。只有菌株本身性狀的劣化，才是退化。避免使用陳舊的培養(yǎng)物作為種子。此法適用于產(chǎn)孢子及芽孢菌種的保藏。 ? 荷蘭“真菌中心收藏所” (CBS)。 ? ?它有哪些特點 ? ? ?基因突變可分哪幾類 ? 復(fù)習(xí)思考題 ? ，說明突變的分子機制。 ? 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心 (CVCC) 農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所 ， 北京 (CIVBP) 。 三、菌種保藏 ? （二）、菌種保藏的方法： ? 斜面菌種低溫保藏法 把斜面菌種、固體穿刺培養(yǎng)物或菌懸液等，直接放入 4～ 5℃ 冰箱中。作為生產(chǎn)菌株需同時采用斜面保藏和其它的保藏方式如冷凍干燥孢子、砂土管及液氮保存等。 一、菌種退化及其防治 ? 環(huán)境條件可以影響菌種退化的速率。其中蘇氨酸、色氨酸、脯氨酸和組氨酸等工程菌已達(dá)到工業(yè)化生產(chǎn)水平。 融合子初篩結(jié)果 菌 號 谷氨酸產(chǎn)率 (g/dl) 菌 號 谷氨酸產(chǎn)率 (g/dl) TG 866( 親株 ) B9( 親株 ) F5 F38 F220 F160 F268 F309 0 0 0 F12 F18 F80 F263 F288 F300 F70 F262 原生質(zhì)體融合基本過程示意圖 第四節(jié) 基因工程 ? 重組 DNA技術(shù)：在體外對不同來源的 DNA分子進行重組，引入合適的寄主細(xì)胞內(nèi)，使之復(fù)制和表達(dá)。 PEG分子量從1000到 12023，融合時多用 4000和 6000兩種。影響因素：① 進行預(yù)處理，加強壁對酶的敏感性。常 一、突變與育種 ? 誘變劑的作用： ① 提高突變頻率； ② 擴大產(chǎn)量變異幅度； ③ 使產(chǎn)量變異向正變 (提高 )或負(fù)變 (降低 )的方向移動。 ? 定向培育：用某一特定因素長期處理某一微生物培養(yǎng)物，同時不斷對它們進行傳代，以達(dá)到累積并選擇相應(yīng)的自發(fā)突變體的一種古老的育種方法。把兩個親體的不同性別的單倍體細(xì)胞密集接觸在一起，有機會出現(xiàn)雙倍體的雜交后代。 ? F′菌株： Hfr的 F因子脫離 DNA,形成攜帶一小段(最多可達(dá) 1／ 3)染色體基因的游離 F因子 ,特稱 F′因子。當(dāng)宿主喪失這一噬菌體時，通過溶原轉(zhuǎn)變而獲得的性狀也同時消失。 外源染色體片段 (雙鏈 DNA)通過雙交換 形成一個穩(wěn)定的轉(zhuǎn)導(dǎo)子圖示 （一）原核微生物基因重組 ? 流產(chǎn)轉(zhuǎn)導(dǎo)：在獲得供體菌 DNA片段的受體菌內(nèi)，轉(zhuǎn)導(dǎo) DNA不能與受體菌 DNA進行重組并 復(fù)制 ，也不迅速消失，（只是借住而已）僅表現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)譯、表達(dá)的現(xiàn)象。分子量＜ 5 105的 DNA片段不能進入細(xì)胞。例如 ， 亞硝酸既能引起堿基對的轉(zhuǎn)換作用 ， 又能誘發(fā)染色體畸變 ； 一些電離輻射也可同時引起基因突變和染色體畸變。 實驗證明，任何性狀既有正向突變，也可發(fā)生回復(fù)突變。 ? A、 條件致死突變型：突變后，在某種條件下可正常生長、繁殖并實現(xiàn)其表型，而在另一條件下卻無法生長、繁殖。 ? 根瘤菌屬中發(fā)現(xiàn)， 具有一系列固氮基因。約等于 2%核染色體 DNA的小型 cccDNA。啟動基因是轉(zhuǎn)錄起始部位。 ? 以放射性 32PO34或 35SO24作為磷源或硫源培養(yǎng) ， 讓 T2噬菌體（只有核酸和蛋白質(zhì)）感染 ，獲得含 32PDNA核心的噬菌體或含 35S蛋白質(zhì)外殼的噬菌體。 ? 肺炎鏈（雙）球菌 ， 球菌，成雙或成鏈，致人肺炎、小鼠敗血癥。 第八章 微生物的遺傳變異和育種 第一節(jié) 遺傳變異的概念及物質(zhì)基礎(chǔ) 第二節(jié) 基因突變與基因重組 第三節(jié) 微生物育種 第四節(jié) 基因工程 第五節(jié) 菌種保藏 第八章 微生物的遺傳變異和育種 ? 生物體最本質(zhì)的屬性之一。有許多不同菌株，有莢膜者具致病性，菌落表面光滑 ，稱 S型；有的不形成莢膜，無致病性，菌落外觀粗糙 ， 稱 R型。 ? 將 32PDNA噬菌體、 35S蛋白質(zhì)外殼噬菌體分別感染無放射性的 ，攪拌離心，觀察。 ? 調(diào)節(jié)基因一般與操縱子有一定間隔距離 (一般小于 100個堿基 )，調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)基因的活動。 分子量為 107Da， （ 千堿基對），其中有 1/3的基因與接合作用有關(guān)。 四、原核生物的質(zhì)粒 ? （六）、降解性質(zhì)粒：可編碼降解復(fù)雜物質(zhì)的酶，利用一般細(xì)菌難以分解的物質(zhì)作碳源。例如， 37℃ 下正常生長，不能在 42℃ 下生長等。 （三）基因突變 機制 ? 誘變機制：顯著提高突變頻率的理化因子，稱為誘變劑。 （三）基因突變 機制 ? 自發(fā)（沒有人工參與所發(fā)生）突變機制： ? A、 背景輻射和環(huán)境因素的誘變：不少“自發(fā)突變”實質(zhì)上是一些原因不詳?shù)牡蛣┝空T變因素長期綜合誘變導(dǎo)致。低濃度溶菌酶處理 ，提高細(xì)胞壁通透性 ， 可提高轉(zhuǎn)化頻率； （一）原核微生物基因重組 ? ④轉(zhuǎn)化：進入的單鏈與受體菌染色體組上的同源區(qū)段配對，接著受體染色體組的相應(yīng)單鏈片段被切除，并被外來的單鏈 DNA所交換和取代，形成雜合 DNA區(qū)段 (它們間的 DNA順序不一定互補，故可呈雜合狀態(tài) )； ? ⑤復(fù)制：染色體組復(fù)制，雜合區(qū)段分離成兩個，其中之一類似供體菌，另一類似受體菌。 ? 受體菌進行分裂時，只有一個子細(xì)胞獲得這段DNA，另一子細(xì)胞僅獲得供體基因的產(chǎn)物 —酶，在表型上出現(xiàn)供體菌的某一特征。 ? 區(qū)別： 溫和噬菌體不攜帶供體菌基因； 噬菌體完整，沒有缺陷。該菌株稱為初生 F′菌株。雙倍體細(xì)胞和單倍體細(xì)胞有很大不同 ,易于識別。過程十分緩慢， “ 守株待兔 ” 。凡在高誘變率的基礎(chǔ)上既能擴大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量 。在細(xì)菌中加入 EDTA、 甘氨酸、青霉素和 D環(huán)絲氨酸等；在放線菌的中加入 1%～ 4%的甘氨酸等；在酵母菌中加入EDTA和巰基乙醇等；在粟酒裂殖酵母中加入 2脫氧葡萄糖等。 ? 研究發(fā)現(xiàn)，融合開始時，強烈脫水引起質(zhì)體粘合，不同程度地形成聚集場，質(zhì)體收縮并高度變形，大量粘著的質(zhì)體形成非常緊密的接觸。 ? 基因工程屬于狹義的遺傳工程，習(xí)慣上所說的遺傳工程多指基因工程。蘇氨酸工程菌在前蘇聯(lián)和日本都已用于工業(yè)生產(chǎn) ,蘇氨酸產(chǎn)量可達(dá) 60g/L以上，我國蘇氨酸產(chǎn)量可達(dá) 20g/L 。不利環(huán)境往往加速突變型生產(chǎn)菌向野生型方向退化。保藏所用的斜面培養(yǎng)基組成應(yīng)根據(jù)不同菌種的特性加以選擇。保藏時間一般不超過 3個月，到時必須進行移接傳代，再放回冰箱。 ? 除了上述保藏中心外 ， 從事微生物研究并保藏有一定數(shù)量各類專業(yè)用微生物菌種的科研單位、大專院校還有近百所。 ? 因重組形式 ? ? F＋ 、 F－ 、 Hfr和 F′菌株的異同，并圖示它們的相互關(guān)系。 ? 美國“農(nóng)業(yè)研究服務(wù)部菌種收藏所” (ARS)設(shè)立“北方地區(qū)研究室” (NRRL)。若把砂土管放在低溫或抽氣后密封，效果更佳。如棲土曲霉 ，培養(yǎng)溫度由 28～ 30℃提高到 30 ～ 34℃ 防止了產(chǎn)孢子能力的衰退。由于雜菌污染導(dǎo)致生產(chǎn)性狀下降也不是退化，通過采取對設(shè)備的清洗、維修、重新殺菌等一系列措施，加強無菌操作，可以避免雜菌的繼續(xù)污染。經(jīng)過兩級克隆，麥迪霉素產(chǎn)生菌產(chǎn)生一種新的紫色化合物，是麥迪霉素與放線紫紅素的雜種化合物，為一種新的抗菌素 ,命名為 MederhodinA。 一、基因工程的基本操作 ? （一）、目的基因的取得： ? ①選擇適宜的給體細(xì)胞，從中采集分離有生產(chǎn)意義的目的基因； ? ②通過反轉(zhuǎn)錄酶的作用由 mRNA合成cDNA(互補 DNA)； ? ③ 用化學(xué)方法合成特定功能的基因。 Ca2*等強烈地促進脂質(zhì)分子的擾動和重新組合，使接觸處的膜形成小區(qū)域的融合，產(chǎn)生小的原生質(zhì)橋并逐漸增大，直至兩個原生質(zhì)體融合。細(xì)菌采用對數(shù)生長后期，放線菌采用對數(shù)生長期到平衡期之間的轉(zhuǎn)換期最為合適。 ? 正變較多出現(xiàn)在偏低劑量中，負(fù)變則相反；經(jīng)多次誘變而提高產(chǎn)量的菌株，更容易出現(xiàn)負(fù)變。 ? 發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門使用的高產(chǎn)菌株，幾乎都是通過誘變育種而大大提高了生產(chǎn)性能的。 ? 形成異核體：聯(lián)結(jié)后 ,原有的兩個單倍體核集中到同一個細(xì)胞中 ,形成雙相異核體。 ? F因子傳遞 “ 滾環(huán)模型 ” ：① F因子的一條 DNA單鏈在特定位置上發(fā)生斷裂； ② 斷裂的單鏈逐漸解開 ， 同時以留下的另一條環(huán)狀單鏈作模板 ， 通過模板的旋轉(zhuǎn) ， 將解開的單鏈通過性菌毛推入 F中 ，同時 在供體細(xì)胞內(nèi) ， 重新合成一條新的環(huán)狀單鏈 ， 取代解開的單鏈 ； ③ F細(xì)胞中 ， 外來 DNA單鏈上也合成一條互補的新 DNA鏈 ， 恢復(fù)成環(huán)狀雙鏈 F因子 ，F(xiàn)變成了 F+。鴨沙門氏菌（ ε15噬菌體）－細(xì)胞表面多糖結(jié)構(gòu)變化。所以，只能在選擇性培養(yǎng)基平板上形成一個微小菌落（即其中只有一個細(xì)胞是轉(zhuǎn)導(dǎo)子）。 轉(zhuǎn)化中單鏈外基因組片段與雙鏈內(nèi)基因組間的交換與整合過程示意圖 （一）原核微生物基因重組 ? 轉(zhuǎn)染：抽提噬菌體或其他病毒的 DNA(或RNA) ，感染感受態(tài)的宿主細(xì)胞，產(chǎn)生正常的噬菌體或病毒后代的現(xiàn)象 。 （三）基因突變 機制 ? B、 自身代謝產(chǎn)物的誘變：過氧化氫是普遍存在于微生物體內(nèi)的一種代謝產(chǎn)物。分為轉(zhuǎn)換（嘧啶或嘌呤同類更換）、顛換（嘧啶或嘌呤異類更換） 。 （一）基因突變類型 ? 按分離： ? 選擇性突變：具有選擇性標(biāo)記，可通過某種環(huán)境條件使它們得到優(yōu)勢生長 ,從而取代原始菌株。 ? 僅在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)。其一稱 RTF質(zhì)粒 (抗性轉(zhuǎn)移因子 )，含有調(diào)節(jié) DNA復(fù)制和拷貝數(shù)的基因及轉(zhuǎn)移基因，有時還有四環(huán)素抗性基因 。 ? 啟動轉(zhuǎn)錄：阻遏蛋白從