【正文】 變化；對(duì)酶活性的檢測(cè)方法要靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)易；酶源豐富價(jià)廉；同時(shí)，酶底物應(yīng)對(duì)人體健康無害。在嚴(yán)格控制交聯(lián)反應(yīng)條件下，使所得到的標(biāo)記產(chǎn)物——結(jié)合物，能保留各組份原有的活性，以便在此后的配體結(jié)合分析中，既能參與與配體高度專一的親和結(jié)合反應(yīng)，又不失去標(biāo)記組份的信號(hào)放大作用，以保證具有很高的靈敏度。一般說來，對(duì)酶結(jié)合物的要求，①具有高的酶活性；②具有高的抗原或抗體免疫活性：②穩(wěn)定性要好。(簡(jiǎn)稱結(jié)合物)。 二、酶 標(biāo) 記 技 術(shù) 通過化學(xué)反應(yīng)(在化學(xué)交聯(lián)劑的作用下)或親和結(jié)合作用，使酶與抗原、半抗原或抗體結(jié)合的過程，稱為酶的標(biāo)記或交聯(lián)。 上述各種類型的標(biāo)記方法，根據(jù)所標(biāo)記的對(duì)象，大體上可分為兩類，一類是對(duì)大分子蛋白質(zhì)的標(biāo)記，另一類是對(duì)小分子物質(zhì)的標(biāo)記。由上述三組(Ag—Ab)免疫反應(yīng)關(guān)系，達(dá)到用酶(HRP)對(duì)抗體(Ab1)的標(biāo)記，這種酶對(duì)抗體的交聯(lián)是不經(jīng)過任何化學(xué)交聯(lián)的免疫學(xué)親和標(biāo)記，故又稱為不標(biāo)記酶法。 (2)生物親和配體交聯(lián)法(或稱間接標(biāo)記法) 標(biāo)記物本身既是(或作為)標(biāo)記物，又是被標(biāo)記物，通過與其相對(duì)應(yīng)的親和配體的親和結(jié)合作用，達(dá)到標(biāo)記之目的。 (2)小分予物質(zhì) ①*H(*Hapten，即半抗原)或 ②*L(*Ligand，即配體)：包括各種藥物、毒物、固醇類激素等小分子物質(zhì)。5) 毒素：白喉毒素、蓖麻毒素及紅豆毒素等，此類物質(zhì)不是用于配體結(jié)合分析的標(biāo)記物，而是用于免疫毒素的制備。激光濁度免疫分析(Laser NephelometriC Immunoassay，lNIA)； b．熒光偏振免疫分析(Fluorescence P0larization Immunoassay，F(xiàn)PIA)； (2)受體分析(Receptor Assay)[8]。膠乳凝集免疫分析(Agglutination Latex Immunoassay)； b。 目前，根據(jù)所用結(jié)合劑的不同，可將配體結(jié)合分析分為三大類：①以抗體為結(jié)合劑者為免疫分析；②以受體為結(jié)合劑者為受體分析；③以特異結(jié)合蛋白為結(jié)合劑者為競(jìng)爭(zhēng)蛋白結(jié)合分析。 在配體結(jié)合的大分子生物活性物質(zhì)稱為結(jié)合劑。以酶免疫分析(Enzyme lmmunoassay，EIA)為例，是以酶標(biāo)記的抗原(或半抗原)和非標(biāo)記的抗原(或半抗原)對(duì)專一性抗體的競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)為基礎(chǔ)，其中抗原—抗體之間的免疫反應(yīng)通式如下：Ag十Ab—＞Ag—Ab 當(dāng)用酶標(biāo)記抗原(E—Ag)檢測(cè)非標(biāo)記的待測(cè)抗原(Ag)時(shí)，兩者便與其特異抗體(Ab)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)結(jié)臺(tái)作用，此即為競(jìng)爭(zhēng)性酶免疫分析的理論基礎(chǔ)：(E—Ag)十Ab——，(E—Ag)一Ab (F) 十 (B) 、Ag AgAb 游離(F)與結(jié)合(B)部分分離后，測(cè)其中(F)a或（B）分的酶活性，則與待測(cè)的非標(biāo)記抗原量成比例。從廣義上講，它們之間可互稱為配體，如抗原是抗體的配體，反之，抗體亦可稱為抗原的配體。在分子藥理學(xué)研究中，配體系指與受體(Receptor)結(jié)合的活性信號(hào)分子。目前，巳初步形成一個(gè)新穎的分析技術(shù)系統(tǒng)——配體結(jié)合分析(Ligand Binding Assay)，這是一類靈敏度高、特異性強(qiáng)的分析系統(tǒng)，已在生物醫(yī)學(xué)各有關(guān)研究領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。7:235．18．Umemoto N，et al．J Appl Biochem l984。 612：40．11．Nilsson P，et al．J Immunol Methods l981；41：81．12．宋振玉，等。 47:5924．8．WOrrell NR，et al．Anticancer Drug Design 1986；1：179．9．Philpott GW，et al．J Immun0l 1980。 參考文獻(xiàn)1．Avrames S，et al．Scand J Immunol 1978，8(suppl 7)：72，Kulkarni PN，et al．Cancer Res 1981 。常用的測(cè)定方法有：1兩種組份的吸收光譜不重疊者，可以選擇合適的波長(zhǎng)分別測(cè)定OD值，計(jì)算兩組份的摩爾濃度，推算結(jié)合比。為了獲得分量更均一的產(chǎn)物，也可以采用高效液相層析、電泳及離子交換柱層析進(jìn)行分離純化。三、結(jié)合物的純化與鑒定 蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)中的小分子如未結(jié)合的藥物、交聯(lián)劑、反應(yīng)副產(chǎn)物可以通過凝膠柱層析、透析或硫酸銨沉淀法與高分子結(jié)合物分離。蛋白分子中的巰基可以由二硫毗啶基的還原產(chǎn)生，也可以通過與2—亞胺基四氫噻吩、3—巰基丙酰 亞胺甲酯、N—乙酰同型半骯氨酸硫代內(nèi)酯或S—乙酰硫代琥珀酸酐等試劑反應(yīng)引入。 由于蛋白質(zhì)分子中通常沒有巰基反應(yīng)活性基團(tuán)，因此，巰基交換反應(yīng)具有較好的選擇性，在一定程度上避免相同分子間的聚合，而且通過定量引進(jìn)巰基及巰基反應(yīng)活性基團(tuán)，可以實(shí)現(xiàn)控制交聯(lián)，以得到化學(xué)專一性和生物專一性更好的交聯(lián)產(chǎn)物。一般來說，巰基可以通過二硫交換反應(yīng)形成二硫鍵，或通過與馬來酰亞胺基上雙鍵的加成反應(yīng)形成硫醚鍵，實(shí)現(xiàn)毒素與蛋白的連接。6，β—溴—孕酮及14—溴代柔紅霉素[3]可以與蛋白分子中引入的巰基反應(yīng)形成以硫醚鍵連接的結(jié)合物。如14—溴代柔紅霉素在微堿性條件可與蛋白IgG結(jié)合，形成抗體導(dǎo)向偶合物[20]。在羰基的。以這種方法交聯(lián)的半抗原分子有睪酮、孕酮、雌酮及18—乙基炔諾酮。 (四)羰基 醛基化合物如吡哆醛及毗哆醛磷酸酯可以通過與蛋白分子上的氨基形成Schiff氏堿，實(shí)現(xiàn)與蛋白的交聯(lián)。但本法也可以產(chǎn)生副產(chǎn)物，而且硼氫化還原可能破壞藥物結(jié)構(gòu)，影響藥物活性[19].用高碘酸鈉氧化抗體IgG分子Fc端的糖基，利用生成的醛基與氨基化合物交聯(lián)。用高碘酸鹽氧化法制備的抗體導(dǎo)向偶合物有柔紅霉素—右旋糖苷—抗體結(jié)合物及柔紅霉素—抗體 偶合物。 具有鄰二醇結(jié)構(gòu)的核苷或核苷酸類化合物，可用高碘酸鹽氧化出醛基，后者可以與蛋白分子上的氨基反應(yīng)形成Schiff氏堿，以硼氫化鈉還原后即可得到穩(wěn)定的以碳—氮單應(yīng)過程中，毋需分離中向產(chǎn)物，本法成功地用于制備地高辛及G毒毛旋花子甙的蛋白結(jié)合物。 酚類化合物可以通過與重氮化的氨基苯甲酸反應(yīng)，引入羧基，然后利用羧基反應(yīng)與蛋白交聯(lián)。三氯三嗪或羧甲基取代的二氯三嗪試劑可以連接藥物分子上的羥基與蛋白分子上的氨基，交聯(lián)分兩步進(jìn)行，羥基化合物先與三嗪試劑反應(yīng)，形成醚衍生物；剩余的取代氯反應(yīng)活性較差，不能再羥基取代，但可與親核性較強(qiáng)的蛋白氨基反應(yīng)，由此形成通過三嗪核偶聯(lián)的結(jié)合物。按照類似方法可以制備環(huán)腺苷酸、雌酮、B—dl美沙醇、3—羥基氯硝安定、蛻皮甾酮、心得安、A9—四氫大麻酚及1—B—D—阿糖呋喃胞苷的蛋白結(jié)合物。在這類化合物的交聯(lián)中，通常先要制備其衍生物，以引進(jìn)能夠與蛋白反應(yīng)的功能團(tuán)。也可以通過與SPDP反應(yīng)，于半抗原分子上引入巰基，利用巰基反應(yīng)與抗體交聯(lián)。為了達(dá)到控制交聯(lián)的目的，可以利用多元酸酐法，于含氨基的半抗原分子上引入游離羧基,然后再以活潑酯法或碳二亞胺法與蛋白交聯(lián)。 以上交聯(lián)方法均是利用同型雙功能交聯(lián)劑連接兩分子上的氨基。通過雙功能交聯(lián)劑苯甲基二異氰酸酯將胺類化合物與蛋白上的氨基連接，可以制備緩激肽的人工抗原結(jié)合物。用此方法連接的半抗原有緩激肽、血管緊張素、托普霉素、慶大霉素、阿霉素、5羥色胺及精脒等。所以這一方法一船不用于抗體導(dǎo)向藥物的制備中。芳香環(huán)上含硝基的化合物如氯霉素，可將硝基還原為氨基后，再制備重氮鹽，與蛋白載體結(jié)合。這兩類胺的交聯(lián)方法有所不同，下面分別討論。通過這種方法與蛋白交聯(lián)的有阿斯匹林、去乙酰長(zhǎng)春花堿、甲狀腺素等。后者在水性介質(zhì)中，很容易和蛋白分子上的醛基或酮基(由高碘酸鈉氧化IgG分子上的糖殘基產(chǎn)生)反應(yīng)，形成腙結(jié)構(gòu)的結(jié)合物。通過混合酸酐法與蛋白載體交聯(lián)的半抗原有考的松—21—琥珀酸半酯、尿核苷—5’—磷酸、睪酮—17—琥珀酸半酯、3—O—琥珀酰毛地黃毒甙配基、膽酸、甲狀腺素及利血平等。類似地，可以制備D，L—10，11—環(huán)氧麝子油酸及蛻皮激素的人工抗原結(jié)合物。 為了減少蛋白分子間的自身聚合，可以先將藥物分子上的羧基轉(zhuǎn)化為N—羥基琥珀酰亞胺的活潑酯，然后再與抗體交聯(lián)。 同時(shí)含有氨基和羧基的小分子，可以先將氨基保護(hù)后，再用羧基與載體交聯(lián)，以避免自身縮合，交聯(lián)反應(yīng)完成后再脫保護(hù)，游離氨基。血管緊張素和緩激肽、促胃液素、嗎啡、前列腺素、托普霉素、1—B—E—阿糖呋喃胞嘧啶、強(qiáng)的松—21—琥珀酸半酯等均可在水溶性碳二亞胺EDC的作用下，與蛋白或多聚氨基酸等載體結(jié)合，制備人工抗原。因此，交聯(lián)方法的選擇以及交聯(lián)物的設(shè)計(jì)主要取決于半抗原或藥物分子上的功能團(tuán)結(jié)構(gòu)，下面就根據(jù)這些功能團(tuán)的分類，分別討論不同交聯(lián)方法的應(yīng)用。如柔紅霉素通過順—烏頭酸與蛋白形成的結(jié)合物，在生理pH時(shí)穩(wěn)定；而進(jìn)入細(xì)胞后，可以在溶酶體的酸性條件(pH4~5)下解離，釋放柔紅霉素原型藥物分子，發(fā)揮細(xì)胞毒作用[14]。又如將細(xì)胞毒分子連接于抗體分子中遠(yuǎn)離抗原結(jié)合位點(diǎn)的Fc區(qū)，可以最大限度地保持抗體活性[13]。 因此，對(duì)細(xì)胞毒分子中藥物活性所必需的部位不宜作不可逆化學(xué)修飾，而且偶聯(lián)鍵要遠(yuǎn)離活性部位，以避免立體位阻對(duì)生物活性的影響。為此，連接藥物與載體的偶合鍵必須能夠在一定條件下以一定速度解離，而且解離速度能夠通過pH的改變或體內(nèi)不同組織小環(huán)境的差異(如酶的種類或活性)得到調(diào)控,以達(dá)到定向給藥的目的；在制備載體藥物結(jié)合物時(shí)，對(duì)藥物分子的結(jié)構(gòu)不宜作永久性的改變，以免引起生物活性的改變；其次還要求每一載體能結(jié)合足夠量的藥物分子，以保證給藥的效率。異型雙功能交聯(lián)試劑的應(yīng)用，基本實(shí)現(xiàn)了交聯(lián)反應(yīng)的控制進(jìn)行，減少或避免了自身聚合和交叉聚合，保證了交聯(lián)產(chǎn)物的有效性。這些性質(zhì)給人工抗原的制備帶來極為有利的條件，人們可以適當(dāng)改變半抗原結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)或引入交聯(lián)活性基團(tuán)，使制備人工抗原的方法更加多樣化。還原青蒿素—蛋白結(jié)合物所誘生的抗體可以用于測(cè)定青蒿素、蒿甲醚及青蒿酯[12]。由這些結(jié)合物產(chǎn)生的抗體能夠識(shí)別半抗原的所有結(jié)構(gòu)特征。例如，與抗—睪酮—17—牛血清白蛋白相比，抗—睪酮—3—牛血清白蛋白能夠更好地識(shí)別類似結(jié)構(gòu)的甾體化合物。一般認(rèn)為藥物結(jié)合量越大越好，但最佳結(jié)合比也取決于半抗原的本質(zhì)及載體的性質(zhì)。必要時(shí)可在半抗原與載體之間引入一定碳鏈長(zhǎng)度的橋結(jié)構(gòu)，暴露抗原決定簇，以利于產(chǎn)生針對(duì)半抗原的抗體。由此，必須根據(jù)結(jié)合物的使用目的，權(quán)衡不同方法的優(yōu)缺點(diǎn)來選擇合適的交聯(lián)方法；最好同時(shí)使用幾種交聯(lián)方法進(jìn)行比較，擇其優(yōu)者而用之。理想的交聯(lián)方法應(yīng)該保證結(jié)合物得率較高，結(jié)合物的組成均一，結(jié)合比合適，最大限度地保持生物活性，操作方便，純化容易；在同樣條件下，重復(fù)性好。②交聯(lián)反應(yīng)的產(chǎn)率。二、交聯(lián)方法的選擇及偶合物的設(shè)計(jì) 如上所述，蛋白質(zhì)交聯(lián)方法的類型繁多，雖然能夠滿足各方面的需要，但也增加了使用者選擇的困難。這是一類比較溫和的交聯(lián)劑，具有較高的反應(yīng)選擇性，但是易形成同類分子的交聯(lián)產(chǎn)物。 (二十二)鹵代乙酰衍生物法 鹵代乙酸的活潑酯衍生物如N—羥基琥珀酰亞胺基碘代乙酸酯分子中的活潑酯成分和α—位活潑鹵素可以分別與蛋白分子中的巰基及氨基反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)兩種分子的交聯(lián)： 本交聯(lián)反應(yīng)迅速，具有較高選擇性，形成的硫醚鍵在血漿中十分穩(wěn)定。通過在二硫鍵的a—位引入位阻性基團(tuán)如甲基，可以增加交聯(lián)物中二硫鍵的穩(wěn)定性。 (二十)SPDP試劑法[6] 異型雙功能交聯(lián)劑N羥基琥珀亞胺基3—(2吡啶基二硫)—丙酸酯(SPDP)可以通過其分子中的活潑酯組份與氨基反應(yīng)，也可以通過2—，然后利用巰基交換反應(yīng)或巰基加成反應(yīng)與另一分子交聯(lián)： 這是目前較為常用的一種交聯(lián)劑，交聯(lián)反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)較少，能夠定量地于蛋白分子中引入保護(hù)的巰基，且能夠方便地測(cè)定其含量。馬來酰亞胺基取代羧酸衍生物的N羥基琥珀酰亞胺酯試劑與含氨基的藥物或蛋白反應(yīng)，引入馬來酰亞胺基，與另—含有游離巰基的分子通過巰基對(duì)雙鍵的加成反應(yīng)連接起來。(十八)E11man試劑法[5] E11man試劑即5．5’—二硫—2，2’—雙硝基苯甲酸(DTNB)，該試劑可以與巰基作用，交聯(lián)反應(yīng)分兩步進(jìn)行： 本法用于游離巰基的保護(hù)和活化，以便與游離巰基的另一蛋白分子進(jìn)行巰基交換反應(yīng)。具有不同碳鏈長(zhǎng)度的亞氨酸酯可將半抗原間以一定距離與蛋白連接。(九)偶氮苯甲酸法 對(duì)氨基苯甲酸重氮化后，與帶苯環(huán)的半抗原偶聯(lián)引入羧基，再利用羧基的反應(yīng)連接于蛋白上：(十)O—羧甲基羥胺法 半抗原上的酮基與O—羧甲基羥胺反應(yīng)，制備羧甲基肟衍生物。由此產(chǎn)生的溶酶體內(nèi)降解性復(fù)合物，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)化后，進(jìn)入溶酶體內(nèi)，在酸性條件下解離。但是，與羥基形成的酯健在血漿中不穩(wěn)定；而與氨基形成的酰胺鍵又往往不能充分降解；釋放游離藥物，影響導(dǎo)向藥物的效價(jià)?；顫婖シㄔ趯?dǎo)向藥物的研究中得到廣泛的應(yīng)用。但是，由于碳二亞胺的縮合反應(yīng)沒有選擇性；易形成蛋白分子間的自身聚合，產(chǎn)生非均一性產(chǎn)物；先將含羧基的藥物或半抗原分子與EDC反應(yīng)，活化羧基后，再加入蛋白反應(yīng)物，可以減少蛋白分子交聯(lián)。水溶性的1—乙基—3—(3—二甲基氨基丙基)—碳二亞胺(EDC)等的出現(xiàn)，使這一縮合反應(yīng)成功地用于蛋白質(zhì)交聯(lián)中。(五)碳二亞胺法 碳二亞胺是一類很強(qiáng)的脫水劑，能使羧基和氨基脫水形成酰胺鍵。這是一個(gè)兩步反應(yīng)，第一步生成醛基衍生物后，過量的過碘酸鹽必須除去或消耗后，方可進(jìn)行與蛋白交聯(lián)的第二步反應(yīng)。因此，多用于酶標(biāo)抗體的制備。以硼氫化鈉或氰基硼氫化還原Schiff氏堿可以形成穩(wěn)定的單鍵；根據(jù)對(duì)偶聯(lián)鍵的不同要求，還原步驟也可省略。 (二)戊二醛法 同型雙功能交聯(lián)劑戊二醛的兩個(gè)醛基可以分別與兩個(gè)相同或不同分子上的伯氨基形成Schiff氏堿，將兩分子以五碳鏈的橋連接起來。 (一)重氮化法含芳香胺的化合物，可以與亞硝酸反應(yīng)形成重氮鹽，然后直接連接于蛋白質(zhì)分子中酪氨酸殘基上酚羥基的鄰位，即得以偶氮鍵相聯(lián)的結(jié)合物。一、交聯(lián)方法 一般說來，蛋白分子中可以用于交聯(lián)的活性基團(tuán)有游離氨基(如賴氨