重組人b淋巴細(xì)胞刺激因子工程菌高密度發(fā)酵-文庫(kù)吧資料
2025-07-05 05:01本頁(yè)面
【正文】 達(dá)外源蛋白的能力會(huì)下降，同時(shí)表達(dá)外源蛋白消耗的大量能量會(huì)促使細(xì)菌的生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期，很容易導(dǎo)致溶菌。誘導(dǎo)后，攜帶質(zhì)粒的細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著降低，而不帶質(zhì)粒的細(xì)胞則不受影響。因此,選用甘油作為碳源較好。我們采用建立的中試發(fā)酵工藝，三批重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果，最終菌體密度均超過(guò)A 600 nm25，菌體獲得量均達(dá)濕質(zhì)量濃度50 g/L 以上，目的蛋白表達(dá)量均高于40%，比試管和搖瓶的表達(dá)水平略有提高，取得了較佳的結(jié)果。在實(shí)際操作中，需要對(duì)各種因素進(jìn)行優(yōu)化，建立最佳的發(fā)酵工藝。 3,5,7: 誘導(dǎo)后蛋白表達(dá)情況.B: 目的蛋白質(zhì)SDSPAGE分析的灰度掃描結(jié)果.3 討 論基因工程菌的發(fā)酵不同于傳統(tǒng)發(fā)酵工藝，前者帶有外源克隆基因的重組表達(dá)載體，發(fā)酵生產(chǎn)的目的是要獲得大量的外源基因產(chǎn)物，盡可能減少宿主細(xì)胞本身蛋白的污染?！KKHTTBLyS/DH5a工程菌補(bǔ)料分批培養(yǎng)的菌體生長(zhǎng)曲線和TTBLyS表達(dá)曲線 1 2 3 4 5 6 7 A B TTBLyS表達(dá)水平的SDSPAGE及灰度掃描鑒定A：1: 蛋白質(zhì)分子量Marker。溫度37℃，溶解氧35%左右，轉(zhuǎn)速于8 h左右達(dá)到800 r/min并開(kāi)始利用純氧。如在早期誘導(dǎo)，雖然表達(dá)量比較高，但是由于誘導(dǎo)劑的抑制效果收菌量明顯下降；在晚期進(jìn)行誘導(dǎo)，盡管誘導(dǎo)時(shí)菌體密度更高，但誘導(dǎo)后細(xì)菌生長(zhǎng)很快進(jìn)入衰亡期，并有自溶傾向，因而表達(dá)外源基因的能力也隨之下降。1 2 3 4 5 6 7 8 9 不同濃度IPTG誘導(dǎo)劑對(duì)于TTBLyS蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響 1: 未誘導(dǎo)菌體總蛋白。 mmol/L IPTG即有誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)的能力，~2 mmol/L時(shí)，IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平?jīng)]有顯著性影響。 5: 誘導(dǎo)4小時(shí)菌體總蛋白。 3: 誘導(dǎo)2小時(shí)菌體總蛋白。1: 未誘導(dǎo)菌體總蛋白。由此確定發(fā)酵結(jié)束時(shí)間可以在誘導(dǎo)后4～5 h，控制在菌體密度開(kāi)始下降前。2 結(jié) 果2. 1 試管培養(yǎng)及條件優(yōu)化2. 1. 1 試管培養(yǎng)中誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的優(yōu)化 試管培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(A600 =), mmol/ L IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)， h取樣一次，SDSPAGE分析表達(dá)情況。一個(gè)單位的A600約為干菌0. 4 g/L。1. 2. 4 重組BLyS表達(dá)量測(cè)定按常規(guī)SDSPAGE檢測(cè)，灰度掃描儀分析重組蛋白占菌體總蛋白的百分含量。當(dāng)pH低于該值時(shí)，通過(guò)流加30%的氨水來(lái)保持恒定?？刂茀?shù)為溶氧及轉(zhuǎn)速：溶氧控制在30%～50%，達(dá)到最大轉(zhuǎn)速800 r/min后, 自動(dòng)通入純氧。. 2 搖瓶培養(yǎng) 2%活化種子接種于含150 ml 2YT的500 ml搖瓶中，37℃，200 r/min振搖培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期，加入IPTG誘導(dǎo)或作為5 L發(fā)酵罐的菌種。1. 2 方法1. 2. 1 試管表達(dá) 取70℃保存甘油菌種，劃線接種于含氨芐(100 μg/ml)的LB平板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單克隆菌落于5 ml LB試管中，37℃，200 r/～，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，將表達(dá)量最高的克隆作為發(fā)酵用種子，分裝冷凍保存，每批發(fā)酵取出一管，以保證菌
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