【正文】 可彎曲，長度約為450nm，細(xì)胞外耐熱溫度為60℃至70℃，在室溫條件下可存活25天。另外也有部分蘭花種類感染后并不表現(xiàn)任何可辨認(rèn)癥狀。感病植株除葉部、莖部產(chǎn)生壞死外，花部也會產(chǎn)生壞死，這是CyMV病毒特有的病癥。主要病毒危害癥狀：（1） 建蘭花葉病毒(CyMV)： 屬于馬鈴薯X病毒屬，能使蘭科花卉產(chǎn)生褪綠斑點及壞死斑，蝴蝶蘭表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)病斑，到開花時，植株出現(xiàn)花朵畸形、花瓣缺、小花簇生于花梗同一部位等癥狀。FeritasAstua(1999)等從在圣保羅（巴西）商貿(mào)農(nóng)場取得來自17個國家的1777個樣本用PTAELISA和電鏡檢測CyMV ，ORSV， CMV，CymRSV，VMV (vanilla mosaic)，得出CyMV、ORSV是主要侵染蘭花病毒的，而沒有一個樣本感染了CMV， CymRSV和 VanMV。 蘭花病毒病分布情況差異極大，但是建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus， CymMV )和齒蘭環(huán)斑病毒(Odontoglossum ringspot virus，ORSV )幾乎遍及全世界，所以圍繞一些蘭科花卉病毒的研究工作最主要集中于建蘭花葉病毒和齒蘭環(huán)斑病毒。Magee（1943）最早記載蘭科花卉病毒病。二、蝴蝶蘭病毒病種類和癥狀1. 病毒種類 蝴蝶蘭為蘭科蝴蝶蘭屬植物，因此與蘭科其他屬植物（6個亞科725屬約25000多個種）具有相同的病毒。 2006年，國內(nèi)蝴蝶蘭市場的產(chǎn)量約在4500萬株，其中60%左右用于出口，但主要集中在瓶苗與大、中、小苗。從2004年起，荷蘭市場蝴蝶蘭消費量從3500萬株上升到2006年的8000多萬株。僅在2005年，預(yù)計到2008年。介體傳毒?；詷O強， 一、蝴蝶蘭種苗生產(chǎn)概況蝴蝶蘭產(chǎn)業(yè)在中國的興起不過十余年，作為花卉業(yè)中的一個新興類別，蝴蝶蘭一直受到中國花卉市場的喜愛。 介體傳播通過帶毒或感染的昆蟲或其他生物介體而完成的傳染作用。目前了解到由種子傳染的病毒有104種，花粉傳染的病毒有10多種。 非介體傳播 通過感病植株本身的有性或無性繁殖材料完成的傳染作用。病毒傳染的途徑1955年他們又獲得了馬鈴薯脫毒苗。病毒隨繁殖代數(shù)增加而綿延不絕，日益增殖，結(jié)果導(dǎo)致植物種性退化，甚至使一些珍稀品種瀕臨絕滅。對無性繁殖作物危害更甚，如薯類、大蒜、生姜、芋頭、草莓和花卉等。其中以病毒病最難控制，成為當(dāng)前生產(chǎn)上的嚴(yán)重問題。此外，在種皮基質(zhì)中還可加入一些對體細(xì)胞胚有益的物質(zhì)，如能促進生長的微生物、營養(yǎng)物質(zhì)、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)、殺蟲劑，以及用于旱地播種的親水性化合物等，作為人工胚乳。 海藻酸鈉(2％～％，W／V)在室溫下為液體。如以腋芽為材料進行人工種子研究的作物有煙草和花葉芋，也有用毛狀根為培養(yǎng)物制作人工種子的研究 。（二）人工種子的研究現(xiàn)狀 早期的人工種子研究僅限于胡蘿卜、苜蓿、芹菜等模式作物，當(dāng)時包埋的材料僅胚狀體；而目前研究范圍己轉(zhuǎn)向水稻、甘薯、棉花等具重要經(jīng)濟價值的糧食作物；包埋材料除用胚狀體外還有胚類似物，即用芽、短技、愈傷組織、花粉胚。經(jīng)過20余年的研究，人工種子的研究取得了很大進展，已能在有菌條件下發(fā)芽成苗或用于大田和溫室生產(chǎn)。我國于1995年首次制成了特種稻的人工種子。完整的人工種子包括體胚、人工胚乳和人工種皮。 七、人工種子 Murashige于1978年在國際園藝植物學(xué)術(shù)討論會上首先提出人工種子的概念。高水平多胺促進體胚發(fā)生。 內(nèi)源激素含量的變化 內(nèi)源IAA含量上升并維持在較高水平是胚性細(xì)胞出現(xiàn)的一個共同標(biāo)志；在胚發(fā)生早期，較高水平的內(nèi)源CTK對體胚發(fā)生似乎是必須或有益的；內(nèi)源ABA有利于體胚發(fā)育和成熟。體細(xì)胞胚發(fā)生與發(fā)育過程中，不僅RNA合成速率遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織，且RNA種類豐富。胚性愈傷組織中的可溶性蛋白質(zhì)含量遠(yuǎn)高于非胚性愈傷組織；而非胚性細(xì)胞的游離氨基酸高于胚性細(xì)胞。在多數(shù)植物的SE發(fā)生中過氧化物酶(POD)的活性較高，同工酶的種類較多。（5）赤霉素：抑制許多植物胚狀體的發(fā)生，但對胚狀體的進一步發(fā)育成熟及胚的萌發(fā)效果很好 培養(yǎng)條件 暗培養(yǎng)對體胚發(fā)生過程中的胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及胚狀體的發(fā)生、發(fā)育和成熟十分關(guān)鍵。(4)乙烯及多胺： 低濃度的乙烯利顯著刺激胚胎發(fā)生，高濃度則抑制胚胎發(fā)生。（3）脫落酸：外源ABA可促進枸杞、石刁柏等胚性愈傷組織的形成和體胚的發(fā)生。但低濃度的生長素是大多數(shù)植物誘導(dǎo)體胚發(fā)生所必需的。植物激素 (1) 生長素類：，特別是單子葉植物。 活性炭 在培養(yǎng)基中加入活性炭也能提高胡蘿卜細(xì)胞胚胎發(fā)生的頻率。這是因為低水平的溶解氧在細(xì)胞內(nèi)會導(dǎo)致高水平的ATP。高濃度的鉀 在野生胡蘿卜中，高濃度的鉀(20mmol／L)是胚胎發(fā)生所必需的。在柑橘體胚發(fā)生中，適當(dāng)濃度的甘油大大刺激了愈傷組織的生長和胚胎發(fā)生，而且能獲得同步控制。然而，若在含有55mmol／L KNO3的培養(yǎng)基中加入少量(5mmol／L)NH4C1形態(tài)的氮，胚胎發(fā)育過程就會出現(xiàn)。氮源 在胡蘿卜葉柄節(jié)段培養(yǎng)物中，只有當(dāng)培養(yǎng)基里含有一定數(shù)量的還原態(tài)氮時，才能出現(xiàn)胚胎發(fā)生過程。MS培養(yǎng)基中含較高水平的NH4NO3和螯合鐵。 預(yù)處理：在一些植物體胚誘導(dǎo)中，如預(yù)先低溫(4℃～8℃)儲藏1—2個月。幼嫩的生殖器官較容易由外植體直接產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎。 五、影響植物體細(xì)胞胚發(fā)生及植株再生的因素 基因型的影響 外植體種類：外植體的類型、所處發(fā)育和生理狀態(tài)以及取材部位等因素均影響體胚發(fā)生。 外植體先愈傷化，然后由愈傷組織細(xì)胞分化成胚，如石龍芮花器愈傷組織成胚，從愈傷組織產(chǎn)生胚狀體最為常見。能產(chǎn)生體細(xì)胞胚胎的外植體有：單倍體的小孢子；二倍體組織如莖段、子葉、莖尖、葉柄、貯藏根的韌皮部和木質(zhì)部等；三倍體的胚乳。 二、體細(xì)胞胚發(fā)生研究的歷史離體條件下的體細(xì)胞胚胎發(fā)生過程最早是在胡蘿卜中由Reinert（1958）和Steward等（1958）發(fā)現(xiàn)的。 第八章 體細(xì)胞胚胎發(fā)生一、體細(xì)胞胚(somatic embryo)或胚狀體(embryoid)的概念 指在植物組織培養(yǎng)中起源于一個非合子細(xì)胞、經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成的具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)。由于光能促進酚的氧化，開始時把培養(yǎng)物置于暗處也可能有助于減輕褐變的問題。在培養(yǎng)基中加入一些抗氧化物，如鹽酸半胱氨酸(100mg／L)、抗壞血酸(50～100mg／L)或者是檸檬酸(150mg／L)。 把由親本植株上直接采集的莖芽，先在一種液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3d，然后再在半固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。 培養(yǎng)基的褐變 褐變的原因： 由外植體的切口表面滲出的酚類物質(zhì)氧化后成為醌類物質(zhì)，使培養(yǎng)基變成暗褐色，從而對組織產(chǎn)生毒害作用。玻璃苗生長繁殖速度下降，最后甚至死亡。培養(yǎng)物污染在植物大規(guī)模微繁期間，即使外植體在一開始進行了嚴(yán)格的表面消毒，某些慢速生長的病原菌(特別是內(nèi)生菌)可能依然存在，但只有在培養(yǎng)物經(jīng)過多次繼代之后，這些污染物才表現(xiàn)出來并被人們所發(fā)現(xiàn)。無性系變異 在商業(yè)性微繁當(dāng)中，一旦無菌培養(yǎng)已經(jīng)建立，人們就禁不住以此為起點連續(xù)繁殖若干世代，結(jié)果就有可能使培養(yǎng)早期發(fā)生的變異(芽變或偶然變異)累積起來。移栽后，最初10～15 d要通過噴霧或罩上透明塑料以保持很高的濕度(90%～100％)。 移栽： 先要輕輕地、徹底地洗掉沾在根上的瓊脂培養(yǎng)基，以免栽后發(fā)霉。 壯苗： 是移栽成活的首要條件，在培養(yǎng)基中加入一定數(shù)量的生長延緩劑如多效唑(PP333)，B9或矮壯素(CCC)等，在很多種植物中都是培育壯苗的一項有效措施。 四、壯苗、煉苗和移栽 需壯苗、煉苗的原因 ：試管苗生長在恒溫、高濕、弱光、無菌和有完全營養(yǎng)供應(yīng)的條件下，雖有葉綠素，但營異養(yǎng)生活，在形態(tài)解剖和生理特性上都有很大脆弱性，如無角質(zhì)層或蠟質(zhì)層，氣孔開張過大且不具備關(guān)閉功能等。 無根苗的嫁接 試管內(nèi)嫁接(微體嫁接): ～ ，以在試管內(nèi)預(yù)先培養(yǎng)出來的帶根無菌苗為砧木，在無菌條件下借助顯微鏡進行嫁接，之后繼續(xù)在試管內(nèi)培養(yǎng)，愈合后成為完整植株再移入土中。在這種情況下，須把插條的基部切口先用標(biāo)準(zhǔn)的生根粉或混在滑石粉中的IBA處理；有些植物如月季，則可先在試管內(nèi)誘導(dǎo)枝條形成根原基，然后再移栽土中，遮蔭保濕，待其生根。根長15mm左右時移栽最為方便，更長的根在移栽時易斷，會降低植株的成活率。4）在生根培養(yǎng)基中減少蔗糖濃度(如減到1％)和增加光照強度，能刺激小植株通過光合作用制造食物的能力，以便由異養(yǎng)型過渡到自養(yǎng)型。 2）誘導(dǎo)生根需要有適當(dāng)?shù)纳L素，最常用的是NAA和IBA，～ mg／L。培養(yǎng)室的溫度一般恒定在25℃左右。光周期嚴(yán)格地說也是不重要的。應(yīng)用液體振蕩培養(yǎng)的一個特殊優(yōu)點是莖芽一邊增殖一邊彼此離散，不必用人工把成簇的莖芽切開。瓊脂 %～％的瓊脂固化。細(xì)胞分裂素使用的 ～5 mg／L，大多數(shù)適當(dāng)?shù)臐舛仁?～ 2 mg／L。如烏飯樹的莖芽在只含1／4強度MS無機鹽的培養(yǎng)基中能長得很好，無機鹽水平再高或是有毒或是并沒什么好效果。 其他因子：培養(yǎng)材料的染色體組，供體植株和外植體的生理狀態(tài)，外植體的細(xì)胞發(fā)育狀態(tài)，培養(yǎng)物的歷史以及內(nèi)生激素水平。在煙草中藍(lán)光促進莖芽分化，紅光刺激生根。天竺葵愈傷組織只有在光照和黑暗周期交替(15～16 h光照最好)條件下才能分化莖芽，培養(yǎng)在連續(xù)光照下的愈傷組織總是白色的，不表現(xiàn)器官發(fā)生。在液體培養(yǎng)基中，則只能愈傷化和分化營養(yǎng)芽 ；（2）滲透壓： 在由馬鈴薯葉肉原生質(zhì)體獲得的愈傷組織中，～ mol／L甘露醇以使?jié)B透壓保持在200到400毫滲透壓摩爾時，才可能出現(xiàn)莖芽的分化。（3）赤霉素對于莖芽的分化有抑制作用:在煙草中，若把正在分化的愈傷組織在黑暗條件下以GA3處理，時間即使短至30～60min，也會減少芽的分化，而且在處理之后48h，所有的擬分生組織或莖芽全都不復(fù)存在。（2）生長素能抑制芽的形成: 在煙草中，濃度低到5μmol／L的IAA即足以完全抑制莖芽的自發(fā)分化。增加培養(yǎng)基中的氨態(tài)氮(或谷氨酰胺、精氨酸、水解酪蛋白等有機形式的還原態(tài)氮)可明顯促進細(xì)胞分裂；增加培養(yǎng)基中的硝態(tài)氮或減少還原態(tài)氮，可顯著抑制細(xì)胞分裂。如在玉米幼胚愈傷組織培養(yǎng)中，通過在培養(yǎng)基中添加5mg／L或10 mg／L AgNO3，抑制組織內(nèi)乙烯的作用。（2）選擇正確的培養(yǎng)基，特別是正確的植物激素種類和濃度，及二者之間正確的配比。 愈傷組織狀況調(diào)整的策略 （1）選擇適當(dāng)?shù)幕蛐秃屯庵搀w。 2 愈傷組織狀態(tài)的調(diào)控 優(yōu)良愈傷組織須具備的特性： (1)高度的胚性或再分化能力，以便得到再生植株；（2）容易散碎，以便用這些愈傷組織建立優(yōu)良的懸浮系；（3）旺盛的自我增殖能力，以便建立大規(guī)模的愈傷組織無性系。多數(shù)情況下誘導(dǎo)愈傷組織既需要生長素，也需要細(xì)胞分裂素。（二）器官發(fā)生型 1 愈傷組織形成的條件 誘導(dǎo)愈傷組織常用的生長素是2，4一D，IAA和NAA，常用的細(xì)胞分裂素是KT和6BA。如卷丹鱗片的頂部、中部和基部均能誘導(dǎo)分化出小鱗莖。隨著小芋塊的增大，分化出的芽也越密集并形成許多小苗，在小苗基部與芋塊交界處分化出白色的根。隨后粒狀芋塊上分化出新的1～4個小突起。 球莖芽型(globose stem bud type) 觀葉海棠的葉柄表面可產(chǎn)生一個個圓球形的小突起（球形莖），小突起的一端產(chǎn)生芽和葉片，另一端長出根，最后形成完整的小植株。胚狀體可從愈傷組織形成，也可不經(jīng)過脫分化直接從子葉、下胚軸和花藥培養(yǎng)形成。器官發(fā)生型(organogenesis type) 外植體先脫分化形成愈傷組織，再分化出器官的方式。（2）、對于需要低溫、高溫或特殊的光周期才能打破休眠的鱗莖、球莖、塊莖和其他器官，應(yīng)當(dāng)在取芽之前進行必要的處理。 一、無菌培養(yǎng)物的建立 外植體的選擇：莖段、莖尖、葉片、嫩芽、鱗莖的鱗片、花器官等。1960年，Morel提出了一個離體無性繁殖蘭花的方法，繁殖系數(shù)極高。超凈工作臺上的紫外燈關(guān)閉以后不要立即走近工作臺，最好讓無菌風(fēng)吹2～3 min后再開始操作。因為農(nóng)桿菌介導(dǎo)法已成為植物基因轉(zhuǎn)移的一個主要方法，在轉(zhuǎn)基因過程中的除菌和抑菌都離不開抗生素，所以使用抗生素已逐漸成為植物組織培養(yǎng)中的滅菌技術(shù)之一。 五、抗生素滅菌 首先必須弄清楚要殺死的是真菌、細(xì)菌還是病毒，是哪類真菌、哪類細(xì)菌或病毒；其次應(yīng)知道使用的抗生素是否對培養(yǎng)的植物組織有不良影響；最后要確定抗生素的使用濃度、使用時期和處理時間的長短。然后用無菌水沖洗3～4次，每次2 min左右。外植體的滅菌：將植物材料先用自來水加洗潔精少許浸泡10min以上，浸泡期間要輕輕攪動幾次，以便使植物材料與溶液充分接觸，然后用自來水沖洗10 min左右。 四、化學(xué)藥物滅菌 鑷子、解剖刀等器具的滅菌：將準(zhǔn)備使用的鑷子、解剖刀等浸入75%酒精中，器具的大半部分都被酒精浸泡。微過濾滅菌的關(guān)鍵部分是微孔濾膜，如要徹底清除細(xì)菌、酵母等微生物。m。液體滅菌時間可依據(jù)體積而定，體積越大，需要時間越長，10L需28min，25L需31min。二、濕熱滅菌濕熱滅菌就是人們平時所說的蒸汽滅菌。 第六章 無菌操作技術(shù)與設(shè)備一、干熱滅菌 干熱滅菌就是在180℃的烘箱內(nèi)對器皿進行殺菌處理，是一種徹底殺死微生物的方法。高溫可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反應(yīng)。NAA、2，4一D、激動素和玉米素在高溫下是比較穩(wěn)定的。將需要滅菌的器皿、培養(yǎng)基等放入鍋內(nèi)，不要裝得太滿，以不超過鍋的容量3／4為宜。 二、培養(yǎng)基的選擇 1．選擇合適的培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基： MS培養(yǎng)基適合于大多數(shù)雙子葉植物，B5和N6培養(yǎng)基適合于許多單子葉植物， White培養(yǎng)基適于根的培養(yǎng) 激素濃度和相對比例的確定 先參考已有的報道，看是否有用相同植物、相同組織或相近者做過成功或失敗的試驗，如果有則直接作為參考；如果沒有，則在建立激素配比中，將每一種擬使用的