【正文】 物生長(zhǎng)所必需的營(yíng)養(yǎng)元素，對(duì)于植物組織培養(yǎng)來(lái)說(shuō)也是必需的。也可構(gòu)成一些特殊的生理活性物質(zhì)，如酶、輔酶以及作為酶的活化劑，參與活躍的新陳代謝。Ｂ、Ｍ n、Ｚ n、Ｃ u、Ｍ o、Ｃ o等，也是植物組織培養(yǎng)中不可缺少的元素，缺少這些物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致生長(zhǎng)，分裂異常。 在制做培養(yǎng)基時(shí)不用Ｆ e2（ＳＯ 4） 3和Ｆ eＣ l3 （因其在 pH５ .２ 以上，易形成Ｆ e（ＯＨ） 3 的不溶性沉淀），而用 Ｆ e ＳＯ 4同時(shí)， 它又是葉綠素形成的必要條件。 (5)微量元素 指小于 ， Ｆ e、Ｂ、Ｍ n、Ｃ u、Ｍ o、Ｃ o等。用量為１～３ mg/l 較為適宜； Ｃ a 是構(gòu)成細(xì)胞壁的一種成分，Ｃ a 對(duì)細(xì)胞分裂、保護(hù)質(zhì)膜不受破壞有顯 22 著作用，常以Ｃ aＣ l2它們常以Ｍ gＳＯ 4制備培養(yǎng)基時(shí)，常以ＫＣ L、ＫＮＯ 3 等鹽類提供。Ｋ增加時(shí)，蛋白質(zhì)合成增加， 維管束、纖維組織發(fā)達(dá)，對(duì)胚的分化有促進(jìn)作用。 (3)鉀 是植物營(yíng)養(yǎng)Ｎ、Ｐ、Ｋ之一。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中， 向培養(yǎng)基內(nèi)添加磷，不僅增加養(yǎng)分、提供能量，而且也促進(jìn)對(duì)Ｎ的吸收， 增加蛋白質(zhì)在植物體中的積累。而磷脂又是原生質(zhì)、細(xì)胞核的重要組成部分。有時(shí)，也添加氨基酸來(lái)補(bǔ)充氮素。銨態(tài)氮對(duì)植物生長(zhǎng)較為有利。在制備培養(yǎng)基時(shí)以硝態(tài)氮和銨態(tài)氮兩種形式供應(yīng)。 ２．無(wú)機(jī)元素 大量元素，指濃度大于 ，有Ｎ、Ｐ、Ｋ、Ｃ a、Ｍ g、Ｓ等。大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)可用自來(lái)水。 它是生命活動(dòng)過(guò)程中不可缺少的物質(zhì)。２Ｈ 2Ｏ 0． 25 H3BO3 ＫＩ ０ .８３ ０ .７５ 煙酸 (Vpp) ０ .５ ０ .５ 鹽酸吡多醇 (VB6) 0． 5 0． 1 鹽酸硫胺素 (VB1) ０ .１ ０ .１ 肌醇 100 甘氨酸 2 3 21 二、培養(yǎng)基的成分 培養(yǎng)基的成分主要可以分水、 無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物、天然復(fù)合物、培養(yǎng)體的支持材料等五大類。６Ｈ 2Ｏ Ｃ uＳＯ 4 Ｈ 2Ｏ ２２ .３ ７ Ｚ nＳＯ ４ ７Ｈ 2Ｏ ３７０ ７２０ Ｋ H2ＰＯ 4 １７０ Ｆ eＳＯ 4常用培養(yǎng)配方如下： 表 3－ 1 MS和 White培養(yǎng)基配方 表 有機(jī)物 ＭＳ (毫克 /升 ) Ｗ hite (毫克 /升 ) ＮＨ 4ＮＯ 3 １６５０ ＫＮＯ 3 １９００ ８０ Ｃ aＣ l2它包括了所有的單糖和維生素 。 20 ５．ＫＭ－８Ｐ培養(yǎng)基 它是 1974年為原生質(zhì)體培養(yǎng)而設(shè)計(jì)的。 其特點(diǎn)是成分較簡(jiǎn)單，ＫＮＯ 3 和（ＮＨ 4） 2ＳＯ 4 含量高。其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽數(shù)量較低， 適于生根培養(yǎng)。 ３． Ｗ hite 培養(yǎng)基 是 1943 年由Ｗ hite 為培養(yǎng)番茄根尖而設(shè)計(jì)的。 其主要特點(diǎn)是含有較低的銨，這可能對(duì)不少培養(yǎng)物的生長(zhǎng)有抑制作用。有些培養(yǎng)基是由它演變而來(lái)的。其養(yǎng)分的數(shù)量和比例較合適， 可滿足植物的營(yíng)養(yǎng)和生理需要。常用的培養(yǎng)基及特點(diǎn)如下： １．ＭＳ培養(yǎng)基 它是 1962 年由Ｍ urashige 和Ｓ koog 為培養(yǎng)煙草細(xì)胞而設(shè)計(jì)的。多數(shù)以發(fā)明人的名字來(lái)命名， 如Ｗ hite培養(yǎng)基，Ｍ urashige 和Ｓ koog 培養(yǎng)基（簡(jiǎn)稱ＭＳ 培養(yǎng)基），也有對(duì)某些成分進(jìn)行改良稱作改良培養(yǎng)基。而到 60 和 70 年代則大多采用ＭＳ等高濃度培養(yǎng)基， 可以保證培養(yǎng)材料對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需要， 并能生長(zhǎng)快、分化快，且由于濃度高，在配制、消毒過(guò)程中某些成分有些出入 ,也不致影響培養(yǎng)基的離子平衡。 培養(yǎng)基的產(chǎn)生最早是 Ｓ acks(1680)和Ｋ nop(1681)，他們對(duì)綠色植物的成分進(jìn)行了分析研究， 根據(jù)植物從土中主要是吸收無(wú)機(jī)鹽營(yíng)養(yǎng)，設(shè)計(jì)出了由無(wú)機(jī)鹽組成的Ｓ acks 和Ｋ nop 溶液，至今仍在作為基本的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基得到廣泛應(yīng)用。對(duì)植物的營(yíng)養(yǎng)要求的不斷認(rèn)識(shí)，對(duì)已有培養(yǎng)基的改進(jìn)，或者將新發(fā)現(xiàn)的植物激素、新的有益成分應(yīng)用于培養(yǎng)基之中，都大大促進(jìn)了組織培養(yǎng)研究的迅速發(fā)展，取得越來(lái)越多的成功。因此，沒(méi)有一種培養(yǎng)基能夠適合一切類型的植物組織或器官，在建立一項(xiàng)新的培養(yǎng)系統(tǒng)時(shí)，首先必須找到一合適的培養(yǎng)基，培養(yǎng)才有可能成功。 復(fù)習(xí)思考題 1．因地制宜建一個(gè)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室，需要哪些組成部分？各部分的作用是什么？ 2．常規(guī)組織培養(yǎng)時(shí)，需要什么設(shè)備和器械？你是否會(huì)用？ 3．組 織培養(yǎng)中， PH有什么作用？如果 PH 過(guò)高或過(guò)低會(huì)有什么后果？ 4．談?wù)劷M織培養(yǎng)中如何根據(jù)外植體的不同調(diào)整適宜的培養(yǎng)溫度？ 第三章 培養(yǎng)基 目的要求： 1．一般掌握培養(yǎng)基的種類、特點(diǎn)和各自的作用 2．掌握基本培養(yǎng)基的配方 3．一般掌握培養(yǎng)基的組成成分和適宜的劑量 4．掌握培養(yǎng)基母液和常用培養(yǎng)基的配制方法和步驟 5．熟練掌握培養(yǎng)基的分裝和滅菌方法 6．一般掌握培養(yǎng)基的篩選辦法 培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)的重要基質(zhì)。 2．植物組織培養(yǎng)常用的設(shè)備和器材有：玻璃器皿，如試管、三角瓶、培養(yǎng)皿等；器械用具，如鑷子、剪刀、解剖刀、解剖針等；儀器設(shè)備，如超凈工作臺(tái)、冰箱、水浴鍋、高壓蒸汽滅菌鍋、烘箱等。 本章小結(jié) 1．植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室一般由洗滌室、配置室、接種 室和培養(yǎng)室構(gòu)成。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。 通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥， 夏季易引起污染。調(diào)節(jié)時(shí)一定要充分?jǐn)嚢杈鶆颉?pＨ值大小調(diào)整可用０ .１Ｍ的Ｎ aＯＨ 和０ .１Ｍ的ＨＣ l來(lái)調(diào)整。一般來(lái)說(shuō)當(dāng)ＰＨ高于６ .５時(shí)，培養(yǎng)基全變硬；低于５時(shí)，瓊脂不能很好地凝固。 表 2１ 不同植物的最適 pＨ值 種 類 最適 PH 值 種 類 最適 PH 值 杜 鵑 4． 0 月 季 5． 8 越 桔 4． 5 胡蘿卜、石刁柏 6． 0 蠶 豆 5． 5 桃 7． 0 番茄、葡萄 5． 7 pＨ值適度因材料而異，也因培養(yǎng)基的組成而不同。 １～２個(gè)大氣壓對(duì)生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，２個(gè)大氣壓以上就對(duì)生長(zhǎng)有阻礙作用， ５～６個(gè)大氣壓生長(zhǎng)就完全停止，６個(gè)大氣壓細(xì)胞就不能生存。濕度過(guò)低會(huì)使培養(yǎng)基喪失大 量水分，導(dǎo)致培養(yǎng)基各種成分濃度的改變和滲透壓的升高 ,進(jìn)而影響組織培養(yǎng)的正常進(jìn)行；過(guò)高時(shí)，易引起棉塞長(zhǎng)霉，造成污染。封口材料直接影響容器內(nèi)濕度情況，但封閉度較高的封口材料易引起通透性受阻，也導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育受影響。 前者又受瓊脂含量的影響。如紅花、烏桕樹的愈傷組織。但在藍(lán)光下， 幾周后才出現(xiàn)愈傷組織，而唐菖蒲子球塊接種 15 天后，在藍(lán)光下培養(yǎng)首先出現(xiàn)芽，形成的幼苗生長(zhǎng)旺盛，而白光下幼苗纖細(xì)。 2．光質(zhì) 光質(zhì)對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。 二、光照 組織培養(yǎng)中光照也是重要的條件之一， 主要表現(xiàn)在光強(qiáng)、光質(zhì)、以及光照時(shí)間方面： 1．光照強(qiáng)度 光照強(qiáng)度對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的增殖和器官的分化有重要影響， 從目前的研究情況看，光照強(qiáng)度對(duì)外植體、細(xì)胞的最初分裂有明顯的影響。 桃胚在 2～ 5℃條件進(jìn)行一定時(shí)間的低溫處理， 有利于提高胚培養(yǎng)成活率。如煙草芽的形成以 28℃為最好， 在 12℃以下， 33℃以上形 成率皆最低。百合的最適溫度是 20℃、月季是 25～ 27℃、番茄是 28℃。低于 15℃時(shí)培養(yǎng)，組織會(huì)表現(xiàn)生長(zhǎng)停止，高于 35℃時(shí)對(duì)生長(zhǎng)不利。 組織培養(yǎng)在最適溫度下生長(zhǎng)分化表現(xiàn)良好， 大多數(shù)組織培養(yǎng)都是在 23～ 27℃之間進(jìn)行 ， 很多研究者采用了 25177。 第三節(jié) 培養(yǎng)條件 在植物組織培養(yǎng)中溫度、光照、濕度等各種環(huán)境條件，培養(yǎng)基組 成、ＰＨ值、滲透壓等各種化學(xué)環(huán)境條件都會(huì)影響組培苗的生長(zhǎng)和發(fā)育。 ４．解剖針 解剖針用于深入到培養(yǎng)瓶中， 轉(zhuǎn)移細(xì)胞或愈傷組織。 分離莖尖分生組織，有時(shí)也用解剖刀。也可以用彎形剪刀，由于其頭部彎曲，可以深入到瓶口中進(jìn)行剪切。 ２．剪刀類 可采用五官科用的中型剪刀。鑷子太長(zhǎng)，使用起來(lái)不靈活。根據(jù)操作的需要有各種類型，若用１００毫升的三角瓶作為培養(yǎng)瓶， 可用２０厘米長(zhǎng)的鑷子。 在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基，貯藏母液，材料的消毒等需要各種化學(xué)實(shí)驗(yàn)用的玻璃器皿，包括 100、 250、 1000 毫升燒杯； 100、 1000 毫升量筒； 100、 1000 毫升試劑瓶（棕色）等等。 這樣經(jīng)濟(jì)方便， 且通氣好?，F(xiàn)在多采用聚丙烯塑料膜作為封口，以線繩結(jié)扎或橡皮圈箍扎。以前封口常用棉塞。一次性塑料容器或帶螺絲帽的玻璃瓶，無(wú)須另外配蓋，使用時(shí)是非常方便的。這類塑料制品多是采用聚丙烯材料制成，能耐高溫，可進(jìn)行高壓滅菌。 目前，培養(yǎng)容器和制備培養(yǎng)基所需的玻璃器皿漸被塑料器皿所代替。工廠化生產(chǎn)可采用廣口的 200ml罐 14 頭瓶，加蓋半透明的塑料蓋，由于瓶口大，所以大量繁殖時(shí)操作方便、 工作效率高，也減少了培養(yǎng)材料的損傷?？捎糜谂囵B(yǎng)較高的試管苗 ，另外也不易污染。這在游 離細(xì)胞、 原生質(zhì)體、花粉等的靜置培養(yǎng)、看護(hù)培養(yǎng)、無(wú)菌種子的發(fā)芽、植物材料的分離等都需采用。由于瓶口較小，亦不易污染。 最常使用的是三角瓶，規(guī)格有 100、 250、 500 毫升等， 一般使用 100 毫升三角瓶，無(wú)論靜止或振蕩培養(yǎng)皆適用。 第二節(jié) 設(shè)備和器材 一、玻璃器皿 在組織培養(yǎng)中配制培養(yǎng)基和 進(jìn)行培養(yǎng)需大量的玻璃器皿。 現(xiàn)代組培實(shí)驗(yàn)室大多設(shè)計(jì)為采用天然太陽(yáng)光照作為能源， 這樣不但可以節(jié)省能源 ,而且組培苗接受太陽(yáng)光生長(zhǎng)良好，馴化易成活。 培養(yǎng)架上裝置日光燈時(shí)，可安裝定時(shí)開關(guān)鐘控制照明時(shí)間，植物組織培養(yǎng)的光照強(qiáng)度一般在 1000～ 4000 勒克斯（ lux）， 每天照明 10～ 16 小時(shí)，也有的需要連續(xù)照明。要求溫度因熱帶植物和寒帶植物等的種類不同而異，最好不同種類 有不同的培養(yǎng)室。寬度一般為 60cm。 培養(yǎng)架大多由金屬制成，一般設(shè)５層， 最低一層離地高約 100厘米，其它每層間隔 30厘米左右，培養(yǎng)架即高 。高度比培養(yǎng)架略高為宜，周圍墻壁要求有絕熱防火的性能。培養(yǎng)室的大小可根據(jù)需要的培養(yǎng)架的大小、數(shù)目、及其它附屬設(shè)備而定。 5．?dāng)R架 貯放高壓滅菌后等待接種的培養(yǎng)基。 解剖鏡上要求帶有照相裝置， 根據(jù)需要隨時(shí)對(duì)所需材料進(jìn)行攝影記錄。 放大４０倍以上操作需要有相當(dāng)熟練的技術(shù)和較好的工具。 3． 解剖鏡 解剖鏡種類較多， 用于分離微莖尖可采用雙筒實(shí)體解剖鏡。超凈空氣的流速為每分鐘 24～ 30m，這已足夠防止附近空氣襲擾而引起的污染，這樣的流速也不會(huì)妨礙采用酒精燈對(duì)器械等的灼燒消毒。在工廠化生產(chǎn)中，接種工作量很大，需要經(jīng)常長(zhǎng)久地工作時(shí)，超凈臺(tái)是很理想的設(shè)備。 2． 超凈臺(tái) 超凈臺(tái)的優(yōu)點(diǎn)是操作方便自如，比較舒適，工作效率高，準(zhǔn)備時(shí)間短。 12 圖 2－ 1 接種箱構(gòu)造圖 長(zhǎng) 700cm,上寬 300cm，下寬 450cm，高 500cm。接種箱可參考圖 2－ 1 自行仿制。接種箱依靠密閉、藥劑熏蒸和紫外燈照射來(lái)保證內(nèi)部空間無(wú)菌。緩沖間最好也安一盞紫外滅菌燈，用以照射滅菌。 無(wú)菌操作室應(yīng)設(shè)有緩沖間，面積 2 m2為宜。 無(wú)菌操作室要求干爽安靜，清潔明亮，在適當(dāng)位 置吊裝 1～ 2盞紫外線滅菌燈，用以經(jīng)常地照射滅菌。 在工作方便的前提下，無(wú)菌操作室宜小不宜大，一般 7～ 8m2；要求地面、天花板及四壁盡可能密閉光潔，易于清潔和消毒。 三、接種室 接種室是是進(jìn)行植物材料的分離接種及培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要操作室。用于干燥需保持 80～ 100℃；進(jìn)行干熱滅菌需保持 150℃，達(dá)１～３小時(shí)；若測(cè)定干物重，則溫度應(yīng)控制在 80℃烘干。通常以電作能源。小規(guī)模實(shí)驗(yàn)室可選用小型手提式高壓滅菌鍋。更大規(guī)?；蛞蟾咝蕰r(shí)，可考慮采用液體自動(dòng)定量灌注設(shè)備。 9．培養(yǎng)基分裝設(shè)備 小型組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室可采用燒杯、漏斗等作為分裝培養(yǎng)基的工具。如果培養(yǎng)基溫度過(guò)高，測(cè)量時(shí)要調(diào)整 pＨ計(jì)上的溫度扭使之和培養(yǎng)基溫度相當(dāng)。首次使用酸度計(jì)前，應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)液調(diào)節(jié)定位，然后固定。電爐應(yīng)配有鋁鍋。 7．恒溫水浴鍋 水浴鍋用于難溶藥品的溶解、瓊脂的溶化等。 6．磁力攪拌器 磁力攪拌器用于加速攪拌難溶的物質(zhì)，如各 種化學(xué)物質(zhì)、瓊脂粉等 。 5．電蒸餾水器 電蒸餾水器， 采用硬質(zhì)玻璃或金屬制成。 4．電子分析天平和托盤天平 電子分析天平精確度為 ，用于稱取大量元素、微量元素、維生素、激素等微量藥品；托盤天平精確度為 ，用于稱取用量較大的糖和瓊脂等。 2．藥品柜 用以放置常用 藥品。洗滌室專門負(fù)責(zé)試管苗出瓶與培養(yǎng)器皿的清洗工作；配置室則負(fù)責(zé)培養(yǎng)基的配制、分裝、包扎和高壓滅菌等工作。在準(zhǔn)備室內(nèi)要完成培養(yǎng)基制備以及試管苗出瓶、清洗與整理工作。備有空干架，以空干涮凈的培養(yǎng)器皿。備有大型塑料筐，用于放置培養(yǎng)器皿。室內(nèi)應(yīng)配備大型水槽，用于培養(yǎng)器皿的洗滌，最好是內(nèi)襯白瓷磚的水泥槽。在實(shí)際中可結(jié)合可行條件，合并一部分。要做到無(wú)菌的條件，需要一定的設(shè)備、器材和用具，同時(shí)還需要人工控制溫度、光照、濕度等培養(yǎng)條件。在設(shè)計(jì)組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室時(shí)，應(yīng)按組織培養(yǎng)程序來(lái)設(shè)計(jì)，避免某些環(huán)節(jié)倒排，引起日后工作混亂。實(shí)驗(yàn)室的大小取決于工作的目的和規(guī)模。 4．植物組織培養(yǎng)技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用主要體現(xiàn)在：快速繁殖優(yōu)良苗