【正文】 重蒸餾水。藥品應(yīng)選取等級(jí)較高的化學(xué)純或分析純。藥品 的稱量及定容都要準(zhǔn)確。各種藥品先以少量水讓其充分溶解，然后依次混合。一般配成大量元素、微量元素、鐵鹽、維生素等母液， 其中維生素、氨基酸類可以分別配制，也可以混在一起。母液配好后放入冰箱內(nèi)低溫保存，用時(shí)再按比例稀釋。 下面以ＭＳ培養(yǎng)基制備為例，來(lái)概述其制備方法。 29 1．大量元素母液可配成 10倍液。用分析天平按表 3－ 2稱取藥品，分別加 100ml左右蒸餾水溶解后，再用磁力攪拌器攪拌，促進(jìn)溶解。注意 Ca2+和 PO43一起混合易發(fā)生沉淀。然后倒入 1000ml 定容瓶中，再加水定容至刻度，即成為１０倍母液。 2．微量 元素母液 可配成 100 倍液。用分析天平按表準(zhǔn)確稱取藥品后，分別溶解，混合后加水定容至 1000ml。 3．鐵鹽母液 可配成 100 倍液，按表稱取藥品，加熱溶解， 混合后加水定容至 1000ml 。 4．維生素、氨基酸母液 可配成 1mg/ml母液。按表稱取藥品，溶解，分別加水定容至 100ml ，其中肌醇為１０ mg/ml的濃度。 5．激素母液的配制 每種激素必須單獨(dú)配成母液，濃度一般配成 1mg/ml。 用時(shí)根據(jù)需要取用。因?yàn)榧に赜昧枯^少，一次可配成５０ ml 或１００ ml。另外，多數(shù)激素難溶于水，要先溶于可溶物質(zhì)。然 后才能加水定容。它們的配法如下： I AA、 IBA、 GA先溶于少量的９５％的酒精中．再加水定容到一定濃度。 NAA可溶于熱水或少量９５％的酒精中，再加水定容到一定濃度。 2,4D可用少量 NaOH溶解后，再加水定容到濃度。 Kt和 BA 先溶于少量 1mol的 HCl中再加水定容。 玉米素先溶于少量９５％的酒精中，再加熱水到一定濃度。 配制好的母液瓶上應(yīng)分別貼標(biāo)簽，注明母液名稱、配制倍數(shù)、日期及配一升培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)取的量。 二、培養(yǎng)基的配制 按表用量筒移取大量元素母液 100ml，用專一對(duì)應(yīng)的移液管分別吸取微量元素母液 10ml、鐵鹽母液 10ml、肌醇母液１０ ml、甘氨酸母液 2ml、 VB1 ml、 VB6 、 Vpp 。均置入１０００ ml定容瓶中 ,若不加任何激素，則為ＭＳ０培養(yǎng)基；若需加激素按配方移取激素母液即可。 將已裝母液的定容瓶用蒸餾水或自來(lái)水定容到１０００ ml，?。保匙笥业谷?30 小鋁鍋中加熱。同時(shí)，稱好３０克蔗糖，稱瓊脂絲７克（或瓊脂粉），也傾入小鋁鍋中，邊加熱邊攪拌，防止糊底。旺火煮開(kāi)，再用文火融化瓊脂。，直至瓊脂全部融化即清澈見(jiàn)底為度。若用瓊脂粉，應(yīng)加入 100ml左右的液體培養(yǎng)基，并攪拌均勻 。然后再傾入定容瓶余下的液體培養(yǎng)基。搖晃均勻即可。 培養(yǎng)基配好后，要調(diào)整 PH值。用 NaOH 或 HCl 液調(diào)到 。在培養(yǎng)基配方不大變動(dòng)的情況下可用經(jīng)驗(yàn)法。即將連續(xù)三次測(cè)定所加的酸或堿液的平均值作為以后調(diào)整的用量值。加后，一定要搖動(dòng)均勻。還要注意酸或堿液不要放置時(shí)間太久。 表 3－ 2 ＭＳ培養(yǎng)基母液的配制 化 合 物 名 稱 規(guī)定量 擴(kuò)大 倍數(shù) 稱取量 母液 體積 1L 培養(yǎng)基 移取量 ＮＨ 4ＮＯ 3 1650 10 16500 1000 100 母 液 1 ＫＮＯ 3 １９００ 1900 10 19000 CaCl2H 2O 440 10 4400 MgSO4 7H 2O 370 10 3700 KH2PO4 170 10 1700 MnSO4H 2O 100 2230 1000 100 母 液 2 ZnSO47H 2O 100 860 CoCl6H 2O 100 CuSO45H 2O 100 25 H3BO3 100 620 Na2MO42H 2O 100 25 KI 100 83 FeSO47H 2O 100 2870 31 Na2EDTA 100 3730 煙酸 (Vpp) 50 25 500 10 母 液 3 鹽酸吡 多醇 50 25 鹽酸硫 胺素 50 5 肌醇 100 50 5000 甘氨酸 2 50 100 四、培養(yǎng)基的分裝與滅菌 培養(yǎng)基合成后，要趁熱分裝， 100ml 的 容器約裝入 3040ml 培養(yǎng)基，即 1升培養(yǎng)基約裝 35 瓶左右。太多則浪費(fèi)培養(yǎng)基，太少不易接種和影響生長(zhǎng)。但要根據(jù)培養(yǎng)對(duì)象來(lái)決定。如果培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)時(shí)，應(yīng)適當(dāng)多裝培養(yǎng)基；生根等短期培養(yǎng)時(shí)，可適當(dāng)少加培養(yǎng)基。分裝時(shí)不要把培養(yǎng)基弄到管壁上，以免日后容易污染。裝后用封口材料包上瓶口，扎口后，寫上培養(yǎng)基種類，準(zhǔn)備滅菌。注意不能放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，以免產(chǎn)生污染 。 培養(yǎng)基用高壓滅菌。打開(kāi)鍋蓋，加水至水位線。把已裝好培養(yǎng)基的三角瓶，連同蒸餾水及接種用具等放入鍋筒內(nèi)，裝時(shí)不要過(guò)分傾斜培養(yǎng)基，以免弄到瓶口上或流出。然后蓋上鍋蓋，對(duì)角旋 緊螺絲，接通電源加熱，當(dāng)升至 ，打開(kāi)放氣閥放氣，回“ 0”后關(guān)閉放氣閥。當(dāng)氣壓上升到 ，保壓滅菌 20分鐘，到時(shí)停止加熱。當(dāng)氣壓回 0后打開(kāi)鍋蓋，取出培養(yǎng)基，放于平臺(tái)上冷凝。滅好的培養(yǎng)費(fèi)基不要放置時(shí)間太長(zhǎng)，最多不能超過(guò) 1周。 第三節(jié) 培養(yǎng)基的選擇 在建立一個(gè)新的實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，為了能研制出一種適合的培養(yǎng)基，最好先由一種已被廣泛使用的基本培養(yǎng)基（如 MS 培養(yǎng)基或 B5培養(yǎng)基）開(kāi)始。當(dāng)通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)，對(duì)這種培養(yǎng)基做了某些定性和定量的小變動(dòng)之后，即有可能得到一種能滿足實(shí) 32 驗(yàn)需要的新培養(yǎng)基。選擇 最佳培養(yǎng)基。常用試驗(yàn)方法主要有單因子試驗(yàn)、多因子試驗(yàn)及廣譜實(shí)驗(yàn)等。 一、單因子試驗(yàn) 單因子試驗(yàn)中，培養(yǎng)基中其它成分都維持在一般水平上，只變動(dòng)一個(gè)因子，以找出這一因子對(duì)試驗(yàn)的影響和影響的程度，例如 MS 基本培養(yǎng)基的其它成分和用量都不變，只變動(dòng) NAA用量對(duì)某一培養(yǎng)物生根的影響，這種只研究一個(gè)因素的試驗(yàn)就是單因子試驗(yàn)。 生物學(xué)試驗(yàn)不同于物理學(xué)或化學(xué)試驗(yàn)，最顯著的差別是在生物學(xué)試驗(yàn)中必需設(shè)置對(duì)照組與試驗(yàn)組，試驗(yàn)組可以有一組或幾組，隨試驗(yàn)的復(fù)雜性增加，對(duì)照組也可能有一組以上。要求對(duì)照組與試驗(yàn)組中的試驗(yàn)個(gè)體，即植物組織塊 或其它培養(yǎng)物，必須在遺傳性、生理狀態(tài)、前培養(yǎng)條件等方面，盡可能完全一致。以保證試驗(yàn)結(jié)果是來(lái)源于試驗(yàn)因子，而不是由于試驗(yàn)材料不一致導(dǎo)致的。 試驗(yàn)中各處理一般都要設(shè)有一定的重復(fù)，以取得可靠的試驗(yàn)結(jié)果。隨試驗(yàn)規(guī)模和要求不同，大多每個(gè)項(xiàng)目要有 4～ 10 瓶，每瓶至少 3塊培養(yǎng)物或 3叢小幼苗。 二、多因子試驗(yàn) 對(duì)培養(yǎng)基中兩個(gè)或兩個(gè)以上因素進(jìn)行研究的試驗(yàn)稱為多因子實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)可采用完全試驗(yàn)方案，也可選用正交設(shè)計(jì)方案，完全試驗(yàn)方案具有均衡完全的特點(diǎn)，各個(gè)因子的每個(gè)水平都相互搭配，構(gòu)成了所有可能的處理組合，如研究 NAA 和 6BA 的最佳濃度組合，每個(gè)因子各設(shè) 5個(gè)濃度水平（ 0、 、 、 10μ mol/l），這兩種因子各種濃度的所有組合，就構(gòu)成了一個(gè)具有 25項(xiàng)處理的試驗(yàn)（表 3－ 3）。 完全試驗(yàn)方案試驗(yàn)因子越多，處理數(shù)越多，試驗(yàn)越復(fù)雜，消耗的精力、物力越多。為了減少試驗(yàn)處理，但又能準(zhǔn)確全面地獲得試驗(yàn)信息，通常采用 正交試驗(yàn) 。例如，采用正交設(shè)計(jì)，在使用此表時(shí)就可以安排 4個(gè)因子， 3種水平的試驗(yàn)，一共做9 種不同搭配的試驗(yàn)，其結(jié)果相當(dāng)于做了 27 次種種搭配的試驗(yàn)。正交試驗(yàn)雖然是多因素搭配在一起的試驗(yàn)，但是在試驗(yàn)結(jié)果的分析中，每一種因素所起的作 用卻又能夠明白無(wú)誤地表現(xiàn)出來(lái)。因此一次系統(tǒng)的試驗(yàn)結(jié)果，就可以把問(wèn)題分析得清清楚 33 楚，用有限的時(shí)間取得成倍的收獲。在組織培養(yǎng)研究中，可用于同時(shí)探求培養(yǎng)基中適宜的幾種成分的用量，如細(xì)胞分裂素、生長(zhǎng)素、糖和其它成分的用量。 表 3－ 3 2 種激素 5種濃度的實(shí)驗(yàn)組合 6BA（ 181。mol/l） 0 5 10 NAA （ 181。mol/l） 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 5 16 17 18 19 20 10 21 22 23 24 25 三、逐步添加和逐步排除的試驗(yàn)方法 在植物組織分化與再生的研究中，在沒(méi)有取得可靠的分化與再生之前，往往添加各種有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，而在取得了穩(wěn)定的再生之后，就可以逐步減少這些成分。在逐步添加時(shí)是使試驗(yàn)成功，在逐步減少時(shí)是縮小范圍，以便找到最有影響力的因子，或是為了實(shí)用上的需要竭力使培養(yǎng)基簡(jiǎn)化，以降低成本和利于推廣。在尋求最佳激素配比時(shí)，也經(jīng)常用到這種加加減減的簡(jiǎn)單方法。此外，還有廣譜實(shí)驗(yàn)法等。 本章小結(jié) 1．培養(yǎng)基多以命名人的名字命名。目前，比較流行的培養(yǎng)基有： MS 培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽和離 子濃度較高； B5培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是含有較低的銨； White培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是無(wú)機(jī)鹽低，適于生根； N6 培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是 KNO3 和（ NH4） 2SO4 含量較高，適于花藥培養(yǎng)； KM－ 8P 培養(yǎng)基，其特點(diǎn)是有機(jī)成分較多，適于原生質(zhì)體培養(yǎng)。 2．水、無(wú)機(jī)鹽、有機(jī)物質(zhì)、天然復(fù)合物、凝固劑是構(gòu)成培養(yǎng)基的五種主要成分。這五種成分有各自的作用效果和要求。 34 3．配制培養(yǎng)基時(shí)，為便于保存，提高效率，通常先配制母液。即先配成大量元素 10 倍液，定容至 1000ml；微量元素 100倍液，定容至 1000ml；鐵鹽 100倍液，定容至 1000ml；維 生素 1mg? l，定容至 100ml；激素 1mg? l，定容至 50～ 100ml。 4．培養(yǎng)基分裝到 100ml的三角瓶，用量一般為每瓶 30～ 40ml，過(guò)多造成浪費(fèi)，過(guò)少則不利于植物的生長(zhǎng)；高壓滅菌時(shí)，壓力通常為 0。 10Mpa， 20 分鐘。 5．篩選合適的培養(yǎng)基一般有四種方法，即單因子試驗(yàn)法、多因子試驗(yàn)法、逐步添加和排除法以及廣譜實(shí)驗(yàn)法。其中，第一種方法比較簡(jiǎn)單，第二種方法比較準(zhǔn)確，而后兩種方法則比較復(fù)雜。 復(fù)習(xí)思考題 1．目前，常用的培養(yǎng)基有哪些？各有什么特點(diǎn)？ 2．培養(yǎng)基包括哪些成分？各有什么作用和適宜濃度范圍？ 3．請(qǐng)回答 MS培養(yǎng)基的基本構(gòu)成？ 4．配制培養(yǎng)基時(shí)，為什么要先配母液？如何配制母液？ 5．怎樣利用母液配制應(yīng)用培養(yǎng)基？ 6．培養(yǎng)基內(nèi)加入活性炭的目的是什么？應(yīng)注意什么問(wèn)題？ 7．實(shí)際使用培養(yǎng)基時(shí)，為什么通常需加入一定量的植物生長(zhǎng)物質(zhì)？ 8．怎樣進(jìn)行培養(yǎng)基的濕熱滅菌？ 9．試比較選擇培養(yǎng)基時(shí)，幾種方法的優(yōu)劣？ 第四章 操作技術(shù) 目的要求： 1．一般掌握滅菌和消毒的區(qū)別 2．掌握滅菌的方法和具體操作過(guò)程 3．掌握無(wú)菌接種的步驟 4．掌握外植體的培養(yǎng)方法和步驟 5．一般掌握外植體褐變和玻璃化的處理方法 6．掌握試管苗馴化的基本程序 35 7．一般掌握快速繁殖試管苗的計(jì)劃安排及增殖倍數(shù)計(jì)算方法 第一節(jié) 滅菌和接種 一、滅菌 滅菌是組織培養(yǎng)重要的工作之一。初學(xué)者首先要清楚有菌和無(wú)菌的范疇。有菌的范疇是：凡是暴露在空氣中的物體， 解除 自然水源的物體，至少它的表面都是有菌的。依此觀點(diǎn)，無(wú)菌室等未經(jīng)處理的地方、超凈臺(tái)表面、簡(jiǎn)單煮沸的培養(yǎng)基、我們使用的刀、剪在未處理之前、我們身體的整個(gè)外表及與外界相連的內(nèi)表，如整個(gè)消化道、呼吸道，即我們呼出的氣體、培養(yǎng)容器無(wú)論洗得多干凈等等都是有菌的。 這里所指的菌，包括細(xì)菌、真菌、放線 菌、藻類及其它微生物。菌的特點(diǎn)是：極小，肉眼看不見(jiàn)。無(wú)處不在，無(wú)時(shí)不有，無(wú)孔不入。在自然條件下忍耐力強(qiáng)，生活條件要求簡(jiǎn)單，繁殖力極強(qiáng)，條件適宜時(shí)便可大量滋生。 無(wú)菌的范疇是：經(jīng)高溫灼燒或一定時(shí)間蒸煮過(guò)后的物體，經(jīng)其它物理的或化學(xué)的滅菌方法處理后的物體 (當(dāng)然這些方法必須已經(jīng)證明是有效的 )，高層大氣、巖石內(nèi)部、健康的動(dòng)、植物的不與外部接觸的組織內(nèi)部，強(qiáng)酸強(qiáng)堿，化學(xué)元素滅菌劑等表面和內(nèi)部等等都是無(wú)菌的。從以上可以看出：在地球表面無(wú)菌世界要比有菌世界小得多。 滅菌是指用物理或化學(xué)的方法，殺死物體表面和孔隙內(nèi)的一切微 生物或生物體，即把所有生命的物質(zhì)全部殺死。與此相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過(guò)消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即消毒后的環(huán)境里、物品上還有活著的微生物。而通過(guò)嚴(yán)格滅菌的操作空間（接種室、超凈臺(tái)、等）和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行操作，就叫做無(wú)菌操作。 植物組織培養(yǎng)對(duì)無(wú)菌條件的要求是非常嚴(yán)格的，甚至超過(guò)微生物的培養(yǎng)要求，這是因?yàn)榕囵B(yǎng)基含有豐富的營(yíng)養(yǎng)，稍不小心就引起雜菌污染。要達(dá)到徹底滅菌的目的，必須根據(jù)不同的對(duì)象采取不同的切實(shí)有效的方法滅菌，才能保證培養(yǎng)時(shí)不受雜菌的影響，使試管苗能正常生長(zhǎng)。 36 常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類，物理方法如干熱（烘燒和灼燒）、濕熱（常壓或高壓蒸煮）、射線處理（超聲波、微波）、過(guò)濾、清洗和大量無(wú)菌水沖洗等措施?；瘜W(xué)方法是使用升汞、甲醛、過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、來(lái)蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適