【正文】 蓋，使平皿在空氣中暴露 5min。 附錄 D 生產(chǎn)環(huán)境采樣與測試方法 （補充件） D1 空氣中 細(xì)菌菌落采樣與測試方法 D1． 1 樣品采集在動態(tài)下進行。 以樣品中環(huán)氧乙烷所對應(yīng)的峰面積（或峰高）在工作曲線上求得環(huán)氧乙烷的量 A（ μg），并以式（ C2）求得產(chǎn)品中環(huán)氧乙烷的殘留量。 根據(jù)保留時間定性，根據(jù)峰面積（或峰高）進行定量計算。 C4． 2 樣品處理 至少取 2 個最小包裝產(chǎn)品，將其剪碎，隨機精確稱取 2g，放入萃取容器中，加入 5mL 丙酮，充分搖勻，放置 4h 或振蕩 30min 待用。按環(huán)氧乙烷小鋼瓶中環(huán)氧乙烷的純度、稀釋倍數(shù)和室溫計算出最后標(biāo)準(zhǔn)氣中的環(huán)氧乙烷濃度。 C4 操作步驟 C4． 1 標(biāo)準(zhǔn)配制 用 100mL 玻璃針筒從純環(huán)氧乙烷小鋼瓶中抽取環(huán)氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)氣（重復(fù)放空二次，以排除原有空氣），塞上橡皮頭，用 10mL 針筒抽取上述 100mL 針筒中純環(huán)氧乙烷標(biāo)準(zhǔn)氣 10mL，用氮氣稀釋到 100mL（可將10mL 標(biāo)準(zhǔn)氣注入到已有 90mL 氮氣的帶橡皮塞頭的針筒中來完成）。 空氣： 350mL/min。 載氣量：氮氣： 35mL/min。 檢測器： 150℃ 。 操作條件： 柱： 15％丁二酸乙二醇聚酯 Chromosorb W HP60～ 80 目；玻璃柱長 2m， φ3mm。 分別于環(huán)氧乙烷消毒后 24h 及以后每隔數(shù)天進行殘留量測定，直至殘留量降至 3． 5 條所規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)值以下。 附錄 C 產(chǎn)品環(huán)氧乙烷殘留量測試方法 （補充件） C1 測試目的 確定產(chǎn)品消毒后啟用時間，當(dāng)產(chǎn)品原料與消毒工藝改變時應(yīng)予測試。 殺菌率 ≥90％，可以報告消毒濕巾有殺菌作用。 B6 計算 式中： A——對照樣品平均回收菌數(shù)； B——試驗樣品平均回收菌數(shù)。 取上述菌懸液，分別在每個被試樣片和對照樣片上滴加 100μL，均勻涂布，開始計時，于 20min 用無菌鑷分別將它們投入含 5mL PBS（ 0． 03mol/L， pH7． 2）的試管內(nèi)（如 是殺菌試驗，則該試管中含 5mL 相應(yīng)中和劑），用手振打 80 次，作適當(dāng)稀釋，然后取其中 2～ 3 個稀釋度，分別吸取 0． 5mL，置于兩個平行平皿，用涼至 40～ 45℃ 的營養(yǎng)瓊脂 15mL 作傾注，轉(zhuǎn)動平皿，使其充分均勻，涼至瓊脂凝固翻轉(zhuǎn)平板， 37℃ 培養(yǎng) 24h，作菌落計數(shù)。 B5 操作 步驟 將試驗菌 24h 斜面培養(yǎng)物用 0． 3mol/LPBS 洗下，制成菌懸液（要求的濃度為：用其 100μL滴 于對照樣片上，回收菌數(shù)為 1104～ 9104cfu/片）。 B4 中和劑試驗 進行殺菌性能測試所選用的中和劑必須能通過以下實驗： 實驗分以下六組進行： 1 組：樣片染菌 5min+5mL 中和劑； 2 組：染菌對照片 +5mL 中和劑； 3 組：樣片 +5mL 中和劑 +染菌對照片； 4 組：染菌對照片 +磷酸鹽緩沖鹽水（ PBS）； 5 組：染菌樣片 +5mLPBS； 6組：培養(yǎng)基對照。 B3 穩(wěn)定性測試條件 B3． 1 自然留樣：將原包裝樣品置室溫下 1 年，進行抑菌或殺菌性能測試。 試驗前，將試驗菌從保存瓊脂斜面上轉(zhuǎn)種，每天轉(zhuǎn)種一次，不超過 2～ 3 周。 B2 試驗菌保存與準(zhǔn)備 試驗菌采用金黃色葡萄球菌（ ATCC 6538）和大腸桿菌（ 8099 或 ATCC 25922）。 定量法：根據(jù)平板上的菌落數(shù)，按式（ A2）計算結(jié)果： 每克樣品真菌菌落數(shù)（ cfu/g）＝平板上菌落平均數(shù) 10 …………… （ A2） 所得結(jié)果超過標(biāo)準(zhǔn)值的 10％，必須重復(fù)檢測一次，以兩次結(jié)果的平均數(shù)為最終結(jié)果。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，置 28℃ 培養(yǎng) 72h 后開始觀察，共培養(yǎng)觀察 7 天，計算平板上菌落數(shù)。 A7 真菌檢測方法 A7． 1 操作步驟 定性法：取樣液 5mL，加入到 50mL 沙氏培養(yǎng)基中，置 20～ 25℃ 培養(yǎng) 7 天，逐日觀察有無真菌生長。 桿菌肽敏感試驗：將被檢菌菌液涂于血平板上，用滅菌鑷子取每片含 0． 04 單位桿菌肽的紙片放在平板表面上，同時以已知陽性菌株作對照，在 37℃ 下放置 18～ 24h，有抑菌帶者為陽性。鏡檢符合上述情況，應(yīng)進行下列試驗： 鏈激酶試驗：吸取草酸鉀血漿 0． 2mL（ 0． 01g 草酸鉀加 5mL 兔血漿混勻，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液），加入 0． 8mL 滅菌生理鹽水，混勻后再加入待檢菌 24h 肉湯培 養(yǎng)物 0． 5mL 和 0． 25％氯化鈣 0． 25mL，混勻，放 37℃ 水浴中， 2min 觀察一次（一般 10min 內(nèi)可凝固），待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時間。溶血性鏈球菌在血平板上為灰白色，半透明或不透明，針尖狀突起，表面光滑，邊緣整齊，周圍有無色透明溶血圈。 A6 溶血性鏈球菌檢測方法 A6． 1 操作步驟：取樣液 5mL 加入到 50mL 匹克肉湯， 37℃ 培養(yǎng) 24h。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物各 0． 5mL 作陽性與陰性對照。試管法：吸取 1∶ 4 新鮮血漿 0． 5mL，放滅菌小試管中，加入等量待檢菌 24h 肉湯培養(yǎng)物 0． 5mL。 血漿凝固酶試驗：玻片法：取清潔干燥載玻片，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔血漿，挑取菌落分別與生理鹽水和血漿混合， 5min 如血漿內(nèi)出現(xiàn)團塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固則為陽性，如兩者 均無凝固則為陰性。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌，排列成葡萄狀，無芽胞與莢膜。在血瓊脂 平板上該菌菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，表面光滑，周圍有溶血圈。 A5 金黃色葡萄球菌檢測方法 A5． 1 操作步驟：取樣液 5mL，加入到 50mL SCDLP 培養(yǎng)液中，充分混勻，置 37℃ 培養(yǎng) 24h。 A4． 2 結(jié)果報告：被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后，證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗均為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。 明膠液化試驗：取可疑菌落純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置 37℃ 培養(yǎng) 24h，取出放于 4～ 10℃ ，如仍呈液態(tài)為陽性，凝固者為陰性。如上層出現(xiàn)粉紅色或紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在。 挑取可疑菌落涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌者應(yīng)進行下列試驗： 氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻棒挑取可疑菌落涂在濾紙片上，然后在其上滴加一滴新配制的 1％二甲基對苯二胺試液， 30s 內(nèi)出現(xiàn)粉紅色或紫紅色，為氧化酶試驗陽性，不變色者為陰性。 從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板，置 37℃ 培養(yǎng) 18～ 24h，觀察菌落特征。 A4 綠膿桿菌測試方法 A4． 1 操作步驟：取樣液 5mL，加入到 50mL SCDLP 培養(yǎng)液中，充分混勻，置 37℃ 培養(yǎng) 18～ 24h。 挑取可疑大腸菌落 1～ 2 個進行革蘭氏染色鏡檢，同時接 種乳糖發(fā)酵管于 37℃ 培養(yǎng) 24h，觀察產(chǎn)氣情況。 如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置 37℃ 培養(yǎng) 18～ 24h，觀察平板上菌落形態(tài)。 A3 大腸菌群檢測方法 A3． 1 操作步驟：取樣液的上清液接種乳糖膽鹽發(fā)酵管。 A2． 2 菌落計數(shù)及結(jié)果報告：菌落呈片狀生長的平板不宜采用；計數(shù)符合要求的平板上的菌落，按式（ A1）計算結(jié)果： 每克樣品細(xì)菌菌落總數(shù)（ cfu/g）＝平板上菌落平均數(shù) 10 ………………… （ A1） 所得結(jié)果超過標(biāo)準(zhǔn)值的 10％，必須重復(fù)檢測一次，以兩次結(jié)果的平均數(shù)為最終結(jié)果。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置 37℃ 培養(yǎng) 24h 后，計算平板上的菌落數(shù)。 A2 細(xì)菌菌落總數(shù)與初始污染菌檢測方法 A2． 1 操作步驟：待上述樣液自然沉降后