【正文】 y在早期即定位表達(dá)于SAM中，且在根外植體再生過(guò)程中有Plfy的活動(dòng)。當(dāng)將根移入CIM中誘導(dǎo)愈傷時(shí)，第二天就在成熟根外周區(qū)域有細(xì)胞分裂的地方發(fā)現(xiàn)了微弱的GUS表達(dá)（圖1D）。而在莖的其他部位、成熟的葉片和根中，沒(méi)有Plfy的活動(dòng)（圖1B）。 ，結(jié)果見(jiàn)圖1所示。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果1. 擬南芥中LFY啟動(dòng)子活動(dòng)特點(diǎn)的驗(yàn)證 白書農(nóng)教授等早年曾利用Plfy::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥為材料，系統(tǒng)檢測(cè)過(guò)在植物發(fā)育早期的SAM中和以根為外植體的植株再生過(guò)程中Plfy的活動(dòng)特點(diǎn)。 原位雜交(1)固定FB 30min甲醇 2次 5min乙醇 4次 5min(2)雜交預(yù)處理乙醇 2次 2min1:1 乙醇:二甲苯 30min乙醇 2次 5min甲醇 2次 5min1:1 甲醇:PBT 10minPBT+5%甲醛 30minPBT 3次 2minPBT+40ug/mL 蛋白酶K 1015minPBT+% 甘氨酸 5minPBT 2次 2minPBT+5% 甲醛 30minPBT 4次 2min1:1 PBT:HS 10minHS 2次 2min預(yù)雜交 2hr 60℃(3)雜交400uL HS + 3uL RNA probe + salmon tests DNA (100ug/mL)（探針和salmon tests DNA預(yù)先85℃變性5min）1620hr 60℃(4)雜交后處理HS 2次 30min 55℃1:1 HS:NTE 60minNTE 60minNTE 2minNTE+40ug/mL Rnase A 45min 37℃NTE 15min 37℃NTE 5次 15min1:1 NTE:PBT 20minPBT 2minBS 至少30min(5)檢測(cè)antiDIG抗體處理a. 等量混合固定后的和新鮮材料+少量冰冷90%丙酮，液氮中磨成細(xì)粉b. 加入更多90%丙酮，使勁混合均勻，4℃儲(chǔ)存過(guò)夜c. 13,000g 5min離心，棄上清。LFY： antisense T3Sense T7(2)Dnase I 于37C處理15分鐘以除去模板，每個(gè)體系加 NaAc和75微升的預(yù)冷的無(wú)水乙醇，20C 過(guò)夜，(3)4C 下離心15分鐘，13000轉(zhuǎn)；(4)70%預(yù)冷的乙醇沉淀一次，吹干后溶于50微升DEPCtreated H2O。體外轉(zhuǎn)錄(1)每個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)含：模板4微升，5*緩沖液4微升，DTT2微升，RNA Block 1uL，5*NTP 4微升，Polymerase 2微升，DEPCH2O 3微升。解剖鏡上接理光XRX 2000相機(jī)照相， 相片通過(guò)Acer ScanPrisa 640U型掃描儀輸入電腦，由Adobe Photoshop 作適當(dāng)處理。d. 待GUS滲入材料中后，材料轉(zhuǎn)入透明液中透明，放置于室溫下3小時(shí)。b. 真空處理210分鐘。(4)設(shè)置重復(fù)，至少35次。等到長(zhǎng)出再生芽和再生根時(shí)，切下芽和根分別作檢測(cè)。(6)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中特別要注意無(wú)菌操作！ GUS活性檢測(cè)(1)當(dāng)植物的根在CIM中培養(yǎng)時(shí)，每隔23天作一次GUS組織化學(xué)染色進(jìn)行跟蹤監(jiān)測(cè)。(4)不論在CIM中還是在SIM中，培養(yǎng)基要每12周續(xù)代一次，及時(shí)更新。(2)三周后，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至SIM中誘導(dǎo)其長(zhǎng)芽。 酶切鑒定及PCR鑒定 。(7)加1mL 70%乙醇洗滌2次。(5)取上清加2倍體積乙醇，振蕩，置2分鐘。(4)再加入150ul溶液Ⅲ（3M NaAc, ），放冰浴中510分鐘，12000rpm 4℃離心5分鐘。沉淀懸浮于100ul溶液Ⅰ中（25mM TrisHCl , 10mM EDTA, 50mM葡萄糖）中，振蕩混勻室溫放置5分鐘。 提質(zhì)粒 用小量堿法提取質(zhì)粒：(1) ，于4℃，12000rpm離心30”。 (5) 涂板(Kan)。 (3) 快速將試管轉(zhuǎn)移至冰上，冷卻2min。 轉(zhuǎn)化(1) ，輕輕旋轉(zhuǎn)，混勻內(nèi)容物，冰上 置30min。(5) 4℃ 4000rpm 8min，回收細(xì)胞。(3) 4℃ 4000rpm 8min，回收細(xì)胞。 大腸桿菌DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞的制備(1) DH5ɑ單菌落接種于2mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，取100200uL菌液于2mL LB中，37℃振蕩培養(yǎng)23小時(shí)后全部轉(zhuǎn)入100LB中，37℃振蕩培養(yǎng)23小時(shí)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=)。(7) ℃或20℃。(5) 去掉注射器，離心2分鐘，使樹(shù)脂/DNA干燥。加2m1的80%異丙醇于注射管中洗Minicolumn。(4) 從Minicolumn去掉注射器，取出推進(jìn)器。 從凝膠中分離純化DNA片段(1) 切下含有DNA片段的膠塊， ml 離心管中, 于70℃溫育直至膠完全融化. 加1 ml 樹(shù)脂(resin), 混合20秒.(2) 去掉注射器上的推進(jìn)器，將Minicolumn安上。 PCR引物 以GFP基因?yàn)槟０宓腜CR引物由本人設(shè)計(jì)，上海生工生物工程公司合成。材料和方法1． 實(shí)驗(yàn)材料 植物材料野生型擬南芥種子（Columbia）Plfy::GUS轉(zhuǎn)基因擬南芥種子（由Detlef Weigel提供）野生型煙草種子（Nicotiana tabacun var. Wisconsin 38）Plfy::GUS轉(zhuǎn)基因煙草種子（由本實(shí)驗(yàn)室畢業(yè)博士生劉復(fù)權(quán)構(gòu)建、提供） 菌種和質(zhì)粒大腸桿菌DH5ɑ質(zhì)粒：Pnfl::GFP (Kan R )Plfy::antiLFY(Kan R )PDW124LFY (Amp R )以上質(zhì)粒均由本實(shí)驗(yàn)室已畢業(yè)博士生劉復(fù)權(quán)構(gòu)建，本實(shí)驗(yàn)室保存