【正文】 32歲77歲），所有標本術(shù)前均未行放療與針對腫瘤的化療，同時取距離腫瘤組織5cm的癌旁正常胃黏膜20例作為對照。 fascin1在癌旁正常胃粘膜及胃癌組織中的表達 fascin1陽性表達主要位于胃癌細胞的胞膜和胞漿（圖①②③），腫瘤間質(zhì)中的血管內(nèi)皮細胞亦可見 fascin1陽性染色；在癌旁正常胃粘膜組織中,毛細血管內(nèi)皮細胞、樹突狀細胞fascin1均呈陽性表達。 fascin1在胃癌細胞和正常胃粘膜細胞中的表達情況 Western Blot法以βactin為內(nèi)參，于相對分子量5．5104處均出現(xiàn)單一蛋白質(zhì)條帶，在胃粘膜正常細胞和三株胃癌細胞中均有fascin1的表達，fascin1蛋白在胃癌細胞中均呈不同程度的陽性表達(如圖4)，而在GES一1中呈低表達，而fascin1蛋白在胃癌細胞中表達較其在GES1中表達的明顯增高。本實驗通過相對定量公式2ΔCt，計算出fascin1的表達水平相對于正常胃粘膜的變化情況。圖②中可以看出，本實驗的熔點曲線在軟件中顯示只有一個峰值，并沒有出現(xiàn)雜峰，提示產(chǎn)物擴增過程無非特異性熒光信號的干擾，目的基因的擴增產(chǎn)物單一，有利于后續(xù)的結(jié)果分析。在RTqPCR擴增反應中，熒光擴增曲線圖主要分為4個特征性階段：基線期、指數(shù)期初期、指數(shù)期和平臺期。本實驗使用燃料法，實驗過程中加入的SYBR熒光染料后，能發(fā)射強熒光信號一旦其特異性地摻入DNA雙鏈，保證了熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加同步，PCR程序每循環(huán)一次就收集一個熒光強度數(shù)據(jù),建立實時擴增曲線,準確地確定Ct值(Ct值:是指每個反應管內(nèi)的熒光信號達到實驗設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)），從而根據(jù)Ct值確定實驗起始DNA的拷貝數(shù),真正意義上，做到的DNA定量。其中，染料法使用的是SYBRGreenI ，它是一種雙鏈DNA結(jié)合染料。RTqPCR在定量起始模板濃度具有專一、靈敏、快速、精確的特性。檢驗進行分析，檢驗水準a=,所有結(jié)果以雙側(cè)P。染色強度分為4級：細胞無顯色：0 分；淺棕色：1 分；著棕色：2 分；深棕色：3 分。 ①陽性細胞數(shù)評分（A）：光學顯微鏡下每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數(shù)100個細胞，陽色細胞數(shù)所占百分數(shù)比規(guī)定為A，陰性或＜5% 陽性細胞表達計0 分，5%25% 計1分，25%50% 計2分，,50%75%計3分，＞75%計4分。（10）磷酸鹽緩沖液沖洗終止顯色，置入蘇木素中復染約1min，再用自來水沖洗干凈，吹風機吹干切片，萊卡自動封片機封片，顯微鏡下觀察。（8）甩去組織切片上的磷酸鹽緩沖液，切片上滴加生物素標記的第二抗體，室溫下孵育20分鐘，磷酸鹽緩沖液沖洗3遍，每次5min。（6）切片上滴加50μl一抗，fascin1抗體 (原液1∶300稀釋)，切片放置于濕盒內(nèi)，置于4 ℃冰箱過夜。 （4）抗原修復：將配制好的檸檬酸鹽修復液，倒入壓力鍋中（一般20張片子以內(nèi)倒800ml檸檬酸鹽抗原修復液），放置于電磁爐上，以“火鍋”模式，大功率(1800w)加熱至沸騰，將放置好組織切片的耐高溫高壓的染色架迅速放入高壓鍋中，一般抗原修復液需覆蓋組織切片，此時將功率調(diào)到中度（800w)，蓋上鍋蓋，當壓力鍋開始噴氣計時2分鐘后，將高壓鍋離開電磁爐，自然冷卻10分鐘，打開鍋蓋取出染色架，打開自來水水龍頭，流水在壓力鍋外壁沖淋以加速冷卻，當冷卻至室溫后取出切片，磷酸鹽緩沖液洗滌2次，每次5分鐘，然后進入染色程序。 （3）每張切片滴加50μl過氧化物酶阻斷劑，用蓋玻片將試劑抹勻讓切片上的組織完全覆蓋。 （1）準備切片：石蠟放20℃冰箱冷凍后切片，60℃烤片40min，切片放入染色架后，采用萊卡自動染色機脫蠟、水化。s）來表示，使用方差分析法比較試驗各組間的數(shù)據(jù)差異。 統(tǒng)計方法 本實驗過程重復三次，實驗數(shù)據(jù)結(jié)果用每組的均數(shù)177。 對提取的蛋白質(zhì)成分的測定，對本實驗的凝膠進行掃描、觀察、拍照，記錄灰度值。，每次10分鐘，然后棄去洗滌液?！姹浞胖眠^夜，取出后置于含PBST的皿中，漂洗10分鐘，后棄去洗滌液，共洗滌3遍10分鐘。（轉(zhuǎn)膜應在低溫下進行，電泳槽應放入裝滿冰塊的盆里，并盡量多加些冰塊） 免疫反應分析提取的蛋白質(zhì)成分：，在室溫條件下，將磷酸纖維膜置于含5%的脫脂牛奶（PBST20毫升和脫脂牛奶1克）的皿中封閉3小時。，分離膠覆于濾紙上，將硝酸纖維膜全部置于分離膠上，整個膜要蓋滿膠(注意膜覆蓋到分離膠后，則不能再移動),膜上面需蓋3張濾紙后除氣泡。，當染色的標記物溴酚藍遷移成一條線，表明進入分離膠)，迅速將電泳的電壓大小調(diào)至120V，此時，電泳分離過程繼續(xù)；，則拔掉電源，停止電泳過程。：用移液器往凝膠梳孔中加細胞樣品混合液，要根據(jù)樣品蛋白濃度計算所加樣品混合液的體積，兩邊的梳孔可以不用，其余梳孔分別加一個樣品，同時用已知分子量的標準蛋白βactin作對照。：5％濃縮膠溶液2ml的配制方法(；30％ ml；lO％SDS ml；PH6．8，1．0mol／1 TrisHCl ml,10％過硫酸銨O．05 ml；)。：10％分離膠溶液5ml的配制方法(；30％；10％SDS 0．05 ml；PH8．8，／；TEMED 0．002ml；10％過硫酸銨0．05 ml)。，各孔樣品的吸光度值；，再計算出每個待測樣品的蛋白質(zhì)濃度。，每孔加入的標準品或待測的蛋白樣品均為25μl，輕輕混勻，每孔待測蛋白樣品應作雙份平行測定。，濃度為2mg/ml，依次稀釋濃度為25μg/ml、125μg/ml、250μg/ml、500μg/ml、1000μg/ml、2000μg/ml，以上訴六個稀釋濃度畫標準曲線。（注意：新配置的BCA工作液在室溫下可穩(wěn)定保存24小時）在配制工作液前，應該根據(jù)所要進行實驗的蛋白樣品的量來計算BCA檢測試劑的使用量。 實時定量反應體系及反應程序 實時熒光定量PCR（每個樣本每個指標設(shè)置3個復孔，共30ul體系，每孔10ul）體系組成： Composition Volume（ul） Template（反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物） 1Primer A （10uM） Primer B （10uM） PCR H2O 13 2X SYBGREEN PCR Master Mix 15本實驗實時熒光定量PCR擴增程序具體如下： Temperature Time 預變性 95℃ 10min40cycles變性 94℃ 5s 退火/延伸 59℃ 30s 待整個循環(huán)結(jié)束后，進行融點曲線分析。再依次加入：4μl 5Reaction buffer2μl dNTP1μl RNase inhibitor搖勻后，37℃水浴加熱5min。，4℃，12000r離心10分鐘，取上層水樣液相入新的EP管，于20℃冰箱凍存，備用。，移液器迅速將細胞裂解物吸入新的EP管。完成以上步驟后，使用Eppendorf紫外分光光度儀測定提取的各組細胞的RNA濃度和純度，則可用于后續(xù)實驗或置于80℃冰箱凍存?zhèn)溆?。℃?000rpm，5min低溫離心，棄上清，置于空氣干燥510min?！?，12000rpm，離心10min，離心前RNA沉淀不可見，離心后在EP管側(cè)壁和底部可見白色膠狀物沉淀。蓋好EP管蓋后，劇烈振蕩15秒，于室溫下，靜置35分鐘。超凈工作臺使用前，使用酒精消毒一遍，紫外線照射消毒至少30分鐘后，戴上無菌手套，從37℃恒溫箱拿出細胞，用巴士無菌吸管吸干培養(yǎng)基后，吸5ml磷酸鹽緩沖液，平放輕搖洗滌細胞，重復洗滌三遍后，吸管吸干廢液倒入廢液缸。 RNA提取 將正常以上四組細胞分別種到25cm178。 d. 吸管輕柔打勻細胞，后吸入無菌、已做好標記的凍存管內(nèi)。b. 胰蛋白酶消化細胞完全后，吸入新離心管，置于離心機1000 rpm/分鐘，離心10分鐘。： 取在培養(yǎng)瓶內(nèi)已經(jīng)生長2－3天，細胞長到80%90%融合時，最好在凍存前一天換液，以保證細胞處于良好的營養(yǎng)狀態(tài)。 ，可見細胞變圓,細胞的邊緣折光性增強,待培養(yǎng)瓶內(nèi)的細胞大部分漂浮,立即加入含血清的培養(yǎng)基,終止消化過程。 細胞傳代取在培養(yǎng)瓶內(nèi)已經(jīng)生長2－3天，細胞長到80%90%融合時，再進行細胞傳代。，輕輕搖晃瓶身，讓培基將細胞表面完全覆蓋。、細胞換液 傳代后次日換液，以后每兩天換液。，加入新鮮培養(yǎng)基重懸細胞沉淀(GES1細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清和1%的青霉素鏈霉素溶液的DMEM高糖培養(yǎng)基中,MKN28，SGC7901，MKN45細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基中),輕輕打勻細胞，置于溫度為37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。,迅速放入37℃水浴箱中,用無菌紗布或無菌手套包住凍存管口，不斷搖晃,使之基本融化(水浴箱的水不能高過凍存管瓶蓋),拿入超凈臺,吸出細胞加入到含5ml完全培養(yǎng)基的新離心管。超凈工作臺使用前，使用酒精消毒一遍，紫外線照射消毒至少30分鐘。②收集齊實驗的患者所有與實驗相關(guān)的臨床病理資料。第二章 材料和方法儀器名稱廠家儀器名稱廠家普通冰箱榮事達耐高溫塑料切片架福州邁新生物公司精密PH計雷磁組織包埋儀亞光，YB7B型電子天平民橋?qū)崟r熒光定量PCR儀德國Eppendorf超凈工作臺北京亞泰隆可調(diào)微量移液器德國Eppendorf直熱式二氧化碳培養(yǎng)箱上海三藤儀器制冰機日本SANYO倒置生物顯微鏡北京中顯恒業(yè)器紫外分析儀UV18cm不銹鋼蘇泊爾壓力鍋細胞計數(shù)板上海安信光學儀器熒光板美國Thermo公司石蠟切片機萊卡公司（德國）水平瓊脂糖電泳槽北京六一組織攤片烤片機湖北博大電子科技 80℃冰箱中科美菱全自動HE染色機萊卡公司（德國）電磁爐福州邁新封片機萊卡公司（德國）恒溫水浴箱JMAX光學顯微鏡日本Olympus CX41搖床其林貝爾病理圖像采集系統(tǒng)美國MOTIC定時器福州邁新生物公司醫(yī)用微波爐福州邁新濕盒福州邁新生物公司試劑名稱公司試劑名稱公司一抗美國Santa兔抗 fascin1稀釋度 1:300DL2000 DNA MarkerGenstarDMEM高糖培養(yǎng)基美國Gibco公司dNTP Genstar1640培養(yǎng)基美國Gibco公司SYBGREEN PCR Mix美國ABI胎牛血清（FBS）美國Gibco公司.美國Sigma胰酶消化液美國Gibco公司免疫組化試劑盒福州邁新pbs溶液南京凱基生物公司檸檬酸鹽緩沖液CB北京中杉金橋DMSO美國Amresco公司PMSF南京凱基生物凍存管美國Amresco公司βactin凱基無水乙醇國藥集團化學試劑公司fascin1引物上海生工生物10ul吸頭axygen逆轉(zhuǎn)錄試劑盒康為世紀200ul吸頭axygenEDTA美國Sigma1ml吸頭axygenTris美國SigmaaxygenTrizol美國Invitrogen15ml離心管corningTaq酶Genstar50ml離心管corningDEPC美國Sigma無粉乳膠手套光明25cm2培養(yǎng)瓶，6孔板corning青霉素鏈霉素溶液南京凱基瓊脂糖西班牙RIPA裂解液強南京凱基 細胞 人正常胃粘膜細胞GES1和胃癌細胞MKN4MKN2SGC7901均購于南京凱基生物公司。上述情況提示 fascin1基因在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的過程可能扮演多種角色。通過體外、體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)fascin1均能促進A549細胞的遷移和侵襲，但對細胞的增殖沒有明顯的作用，fascin1在肺非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)移的重要作用，其將來可能的成為預防非小細胞肺癌轉(zhuǎn)移靶基因[20]。有學者研究發(fā)現(xiàn)膀胱癌中fascin1高表達，并且隨著腫瘤浸潤程度的加深，fascin1的表達水平也隨著升高[18]。在侵襲性較強的雌激素(E