【正文】 離心分離純化出胰島細胞。單核細胞經(jīng)洗滌后置入含 20％胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，在 37℃ ， 5％ CO2條件下培養(yǎng)，第 5 天分別加入細胞因子 IL GMCSF。 方法： 1．不同 STZ 劑量建立糖尿病動物模型：將 36只雄性， 6～ 8周 SPF級的 BALB/c 小鼠完全隨機分為 G1(對照組 )、 G G3和 G4組，進行糖尿病小鼠建模試驗，分別用檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液和 80mg/kg、 200mg/kg、 240mg/kg 三種濃度的 STZ進行腹腔注射，監(jiān)測小鼠血糖濃度，分析建模成功率和生存率，確定最佳建模劑量。 樹突狀細胞 (dendritic cell， DC)的外周致耐受作用通常由未成熟樹突狀細胞 (immature dendritic cell， imDC)介導(dǎo)，由于 imDC不表達共刺激分子，當 imDC 攜帶自身抗原移行至外周淋巴組織后不能使 T細胞活化，從而誘導(dǎo) T 細胞無能，導(dǎo)致自身耐受。 糖尿病是嚴重威脅人類生命與健康的全球性多發(fā)病，胰島素替代治療不能阻止其并發(fā)癥的出現(xiàn)，而 β 細胞替代治療 (包括胰腺移植和胰島細胞移植 )能達到生理性調(diào)控胰島素分泌的目的，并維持正常血糖。 2．小鼠骨髓細胞經(jīng)體外低劑量細胞因子誘導(dǎo)，可擴增分化充足的 imDC。 4． T1 組糖尿病小鼠的血糖濃度始終維持在糖尿病水平，體重隨時間延長而下降，且部分小鼠病程中出現(xiàn)皮毛污穢粘連、高滲性昏迷，感染等表現(xiàn)；T2組小鼠經(jīng)腎 被膜下異種胰島細胞移植后血糖濃度很快恢復(fù)至正常水平，體重上升，但是術(shù)后 5 天血糖開始再次升高，體重隨之下降，表明單純胰島細胞移植排斥反應(yīng)強烈，胰島細胞短期內(nèi)失功； T3組和 T4組小鼠經(jīng)外周靜脈注射經(jīng)供體抗原修飾的自身骨髓細胞培養(yǎng)分化的 imDC后行腎被膜下異種胰島細胞移植，移植后小鼠血糖濃度在術(shù)后第 2天左右恢復(fù)正常，并且血糖濃度維持在正常水平的時間較 T2組明顯延長，體重未見明顯下降。 3．每只 Wistar 大鼠胰腺可分離純化出胰島細胞約 個。 結(jié)果： 1．小鼠經(jīng)腹腔注射不同劑量 (80mg/kg， 200mg/kg、 240mg/kg)STZ 誘導(dǎo)糖尿病模型的成功率分別為：0％， ％和 ％； 200mg/kg 和 240mg/kg STZ 腹腔注射組誘導(dǎo)糖尿病模型小鼠實驗觀察期內(nèi)的生存率分別為： ％和 40％。其中 T1組為糖尿病對照組，腎被膜下注射等量 RPMI1640 液； T2組為單純胰島細胞移植組，腎被膜下移植異種胰島細胞； T3組和 T4 組為經(jīng) imDC 預(yù)處理后異種胰島細胞移植組，外周靜脈注射供體骨髓細胞培養(yǎng)擴增的 imDC 后經(jīng)腎被膜下胰島細胞移植。用 DTZ和 AOPI 染色分別鑒定胰島細胞的形態(tài)和存活率。第 7天收取貼壁細胞，標定單克隆抗體，經(jīng)流式細胞儀鑒定細胞數(shù)量及 imDC 比例。 2． imDC 提取和培養(yǎng)：將 20只雄性， 6～ 8周 SPF級的 BALB/c 小鼠，取股骨、脛骨沖洗骨髓，沖洗液經(jīng)淋巴細胞分離液離心，提取單核細胞?；谶@一理論，建立小鼠糖尿病模型，經(jīng)外周循環(huán)注射負載供體抗原的小鼠 imDC 誘導(dǎo)異種免疫耐受后，移植大鼠胰島細胞，觀察糖尿病小鼠移植物存活時間和移植物排斥 反應(yīng)。但是移植物排斥反應(yīng)始終影響移植效果，甚至導(dǎo)致移植胰島失功。 3．異種胰島細胞移植術(shù)前注射 imDC可明顯延長糖尿病小鼠移植術(shù)后血糖濃度維持正常水平的時間，和單純胰島細胞移植組相比可明顯減輕移植排斥反應(yīng)，延長移植物存活時間。 結(jié)論： 1．一次性腹腔注射STZ200mg/kg 誘導(dǎo) BALB/c 小鼠的糖尿病模型成功率和生存率明顯優(yōu)于STZ80mg/kg 和 STZ240mg/kg 注射組。胰島細胞的純化達到 80％，存活率為 95％。 2．小鼠骨髓來源細胞經(jīng)低劑量 GMCSF 聯(lián)合 IL4擴增出的細胞具有典型 DC 的形態(tài)特征，并且高度表達 imDC的表面分子，基本不表達成熟 DC 的表面分子。監(jiān)測各組糖尿病小鼠實驗干預(yù)后血糖、體重及皮毛等變化。 4． imDC 預(yù)處理和胰島細胞移植：將 40 只 BALB/c 小鼠完全隨機分為 T T T T4組，建立糖尿病模型。 3．胰島細胞提取和純化移植：30只雌性， 8～ 10 周 SPF 級 Wistar 大鼠，無菌取胰腺并經(jīng)膠原酶適度消化，消化液經(jīng)密度梯度離心分離純化出胰島細胞。單核細胞經(jīng)洗滌后置入含 20％胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，在 37℃ ， 5％ CO2條件下培養(yǎng)，第 5 天分別加入細胞因子 IL GMCSF。 方法： 1．不同 STZ 劑量建立糖尿病動物模型：將 36只雄性， 6～ 8周 SPF級的 BALB/c 小鼠完全隨機分為 G1(對照組 )、 G G3和 G4組，進行糖尿病小鼠建模試驗，分別用檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液和 80mg/kg、 200mg/kg、 240mg/kg 三種濃度的 STZ進行腹腔注射，監(jiān)測小鼠血糖濃度，分析建模成功率和生存率，確定最佳建模劑量。樹突狀細胞 (dendritic cell， DC)的外周致耐受作用通常由未成熟樹突狀細胞 (immature dendritic cell， imDC)介導(dǎo)，由于 imDC不表達共刺激分子，當 imDC 攜帶自身抗原移行至外周淋巴組織后不能使 T細胞活化，從而誘導(dǎo) T 細胞無能，導(dǎo)致自身耐受。 糖尿病是嚴重威脅人類生命與健康的全球性多發(fā)病，胰島素替代治療不能阻止其并發(fā)癥的出現(xiàn)，而 β 細胞替代治療 (包括胰腺移植和胰島細胞移植 )能達到生理性調(diào)控胰島素分泌的目的，并維持正常血糖。 2．小鼠骨髓細胞經(jīng)體外低劑量細胞因子誘導(dǎo)，可擴增分化充足的 imDC。 4． T1 組糖尿病小鼠的血糖濃度始終維持在糖尿病水平，體重隨時間延長而下降，且部分小鼠病程中出現(xiàn)皮毛污穢粘連、高滲性昏迷，感染等表現(xiàn)；T2組小鼠經(jīng)腎被膜下異種胰島細胞移植后血糖濃度很快恢復(fù)至正常水平，體重上升，但是術(shù)后 5 天血糖開始再次升高，體重隨之下降，表明單純胰島細胞移植排斥反應(yīng)強烈，胰島細胞短期內(nèi)失功； T3組和 T4組小鼠經(jīng)外周靜脈注射經(jīng)供體抗原修飾的自身骨髓細胞培養(yǎng)分化的 imDC后行腎被膜下異種胰島細胞移植，移植后小鼠血糖濃度在術(shù)后第 2天左右恢復(fù)正常，并且血糖濃度維持在正常水平的時間 較 T2組明顯延長，體重未見明顯下降。 3．每只 Wistar 大鼠胰腺可分離純化出胰島細胞約 個。 結(jié)果： 1．小鼠經(jīng)腹 腔注射不同劑量 (80mg/kg， 200mg/kg、 240mg/kg)STZ 誘導(dǎo)糖尿病模型的成功率分別為：0％， ％和 ％； 200mg/kg 和 240mg/kg STZ 腹腔注射組誘導(dǎo)糖尿病模型小鼠實驗觀察期內(nèi)的生存率分別為： ％和 40％。其中 T1組為糖尿病對照組，腎被膜下注射等量 RPMI1640 液； T2組為單純胰島細胞移植組，腎被膜下移植異種胰島細胞； T3組和 T4 組為經(jīng) imDC 預(yù)處理后異種胰島細胞移植組，外周靜脈注射供體骨髓細胞培養(yǎng)擴增的 imDC 后經(jīng)腎被膜下胰島細胞移植。用 DTZ和 AOPI 染色分別鑒定胰島細胞的形態(tài)和存活率。第 7天收取貼壁細胞，標定單克隆抗體，經(jīng)流式細胞儀鑒定細胞數(shù)量及 imDC 比例。 2． imDC 提取和培養(yǎng)：將 20只雄性， 6～ 8周 SPF級的 BALB/c 小鼠，取股骨、脛骨沖洗骨髓，沖洗液經(jīng)淋巴細胞分離液離心，提取單核細胞。基于這一理論，建立小鼠糖尿病模型，經(jīng)外周循環(huán)注射負載供體抗原的小鼠 imDC 誘導(dǎo)異種免疫耐受后，移植大鼠胰島細胞，觀察糖尿病小鼠移植物存活時間和移植物排斥反應(yīng)。但是移植物排斥反應(yīng)始終影響移植效果，甚至導(dǎo)致移植胰島失功。 3．異種胰島細胞移植術(shù)前注射 imDC可明顯延長糖尿病小鼠移植術(shù)后血糖濃度維持正常水平的時間，和單純胰島細胞移植組相比可明顯減輕移植排斥反應(yīng)，延長移植 物存活時間。 結(jié)論： 1．一次性腹腔注射STZ200mg/kg 誘導(dǎo) BALB/c 小鼠的糖尿病模型成功率和生存率明顯優(yōu)于STZ80mg/kg 和 STZ240mg/kg 注射組。胰島細胞的純化達到 80％，存活率為 95％。 2．小鼠骨髓來源細胞經(jīng)低劑量 GMCSF 聯(lián)合 IL4擴增出的細胞具有典型 DC 的形態(tài)特征，并且高度表達 imDC的表面分子，基本不表達成熟 DC 的表面分子。監(jiān)測各組糖尿病小鼠實驗干預(yù)后血糖、體重及皮毛等變化。 4． imDC 預(yù)處理和胰島細胞移植：將 40 只 BALB/c 小鼠完全隨機分為 T T T T4組，建立糖尿病模型。 3．胰島細胞提取和純化移植：30只雌性， 8～ 10 周 SPF 級 Wistar 大鼠，無菌取胰腺并經(jīng)膠原酶適度消化，消化液經(jīng)密度梯度離心分離純化出胰島細胞。單核細胞經(jīng)洗滌后置入含 20％胎牛血清的 RPMI1640 培養(yǎng)基中，在 37℃ ， 5％ CO2條件下培養(yǎng)，第 5 天分別加入細胞因子 IL GMCSF。 方法： 1．不同 STZ 劑量建立糖尿病動物模型：將 36只雄性， 6～ 8周 SPF級的 BALB/c 小鼠完全隨機分為 G1(對照組 )、 G G3和 G4組，進行糖尿病小鼠建模試驗，分別用檸檬酸 檸檬酸鈉緩沖液和 80mg/kg、 200mg/kg、 240mg/kg三種濃度的 STZ進行腹腔注射，監(jiān)測小鼠血糖濃度，分析建模成功率和生存率，確定最佳建模劑量。樹突狀細胞 (dendritic cell， DC)的外周致耐受作用通常由未成熟樹突狀細胞 (immature dendritic cell， imDC)介導(dǎo)，由于 imDC不表達共刺激 分子，當 imDC 攜帶自身抗原移行至外周淋巴組織后不能使 T細胞活化，從而誘導(dǎo) T 細胞無能，導(dǎo)致自身耐受。 糖尿病是嚴重威脅人類生命與健康的全球性多發(fā)病，胰島素替代治療不能阻止其并發(fā)癥的出現(xiàn)，而 β 細胞替代治療 (包括胰腺移植和胰島細胞移植 )能達到生理性調(diào)控胰島素分泌的目的，并維持正常血糖。 2．小鼠骨髓細胞經(jīng)體外低劑量細胞因子誘導(dǎo)，可擴增分化充足的 imDC。 4． T1 組糖尿病小鼠的血糖濃度始終維持在糖尿病水平，體重隨時間延長