【正文】 在某一發(fā)育時期或特定組織中的表達(dá)。 將抗體從動物血清中提出后 ， 與標(biāo)記物相結(jié)合 ， 即成為 標(biāo)記抗體 。 肽和蛋白質(zhì)均具有抗原性 。 通常冷凍切片的質(zhì)量比石蠟切片要差 ，也很難進(jìn)行連續(xù)切片 ， 但 方便快捷 ,對樣品中蛋白質(zhì)和核酸的保存也較好 。 石蠟切片術(shù) (paraffin sectioning)： 取材 、 固定 、 脫水 、 包埋 、 切片 (5～ 10181。 ? 要觀察到胚胎的內(nèi)部結(jié)構(gòu) ， 通常要進(jìn)行組織切片 。 傳統(tǒng)的熒光顯微鏡的最大缺點(diǎn)是成像質(zhì)量差 。 某些熒光物質(zhì)(如熒光標(biāo)記染料或熒光蛋白 )在一定波長的激發(fā)光照射下會發(fā)出熒光 。 當(dāng)電子束技射到密度大 、 吸附重金屬多的結(jié)構(gòu) (如溶酶體 )時 ， 電子被散射得多 ， 因此 ， 射落到熒光屏上的電子少而呈暗像 ， 電鏡照片上呈黑或深灰色 ， 習(xí)慣稱該結(jié)構(gòu)為 高電子密度 ；反之呈淺灰色 ， 稱低電子密度 。例如， 相差顯微鏡 (phase contrast microscope)和微分干涉差顯微鏡 (differential interference. contrast microscope)適用于觀察活的或未染色的樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu) . ? 取材、固定、 脫水、 包埋、制片、染色、觀察 透射電鏡術(shù) :取材 、 固定 、 脫水、 包埋 、 制片 、 染色 、觀察 ? 組織塊 (lmm3)用 戊二醛與餓酸兩次固定 ， 脫水后樹脂包埋 ， 用超薄切片機(jī)切片 ， 再經(jīng)醋酸鈾和擰橡酸鉛染色 。 線蟲 胚胎發(fā)育過程中的細(xì)胞分裂方式一成不變 ， 其細(xì)胞譜系已被完全確定 (圖緒 .11).幼蟲經(jīng) 4次蛻皮成為成體 ， 然后在 3天內(nèi)產(chǎn)下300多個卵 ， 并在 2周后死亡 . 五、發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù) (一 )常用發(fā)育生物學(xué)研究技術(shù) 由于胚胎個體通常很小，顯微鏡和解剖鏡仍是發(fā)育生物學(xué)研究的必備工具。 腹裂在 290細(xì)胞時期合 。 隨后由 C和 D細(xì)胞產(chǎn)生的肌細(xì)胞 和由 ABa細(xì)胞產(chǎn)生的咽 細(xì)胞也依次由腹裂 (ventral cleft)卷入胚胎內(nèi)部 。 線蟲胚胎的 “ 原腸作用 ” 持續(xù)時間較長 。 P4 細(xì)胞是生殖細(xì)胞前體 。AB細(xì)胞繼續(xù)分裂為 ABa和 ABp細(xì)胞 。 胚胎的前后軸是由精子人卵處決定的 ， 精子入卵的部分成為胚胎的后端 。 雄體性腺為 單臂狀 ， 只能產(chǎn)生精子 。 卵子細(xì)胞核產(chǎn)生于性腺遠(yuǎn)端 ， 通過減數(shù)分裂形成 ， 它們 最初以合胞體狀態(tài)存在 ， 直到受精前才形成完整的細(xì)胞膜 。 雌雄同體 性腺為雙臂狀 ， 開口至腹側(cè)中部的陰門 。 消化系統(tǒng)包括咽和腸道 。 成熟的雌雄同體個體具有 959個體細(xì)胞 ， 約 2 000個生殖細(xì)胞 。 線蟲的基因組測序已在 1998年完成 (共含 19 099個基因 ) ， 是第一個完成全基因組測序的多細(xì)胞動物 . 線蟲 分雌雄同體 和 雄性 兩性別 ， 雌雄同體為主要形式 .雌雄同體個體的性染色體為 xx型 ， 而雄性個體為 xo型 ， 只一條性染色體 .雄體是減數(shù)分裂過程中由于染色體丟失造成的 。 線蟲成蟲僅 約 1mm長 ， 構(gòu)造簡單 ， 全身透明 ， 細(xì)胞數(shù)目少 ， 發(fā)育中的 細(xì)胞譜系 (cell lineage)幾乎固定 ， 易于追蹤 。 成蟲盤是在胚胎發(fā)育階段由特定區(qū)域的表皮細(xì)胞群內(nèi)陷形成的囊狀結(jié)構(gòu) 。 在變態(tài)過程中大部分幼蟲組織被吸收而被成體結(jié)構(gòu)所代替 。 幼蟲表皮具有規(guī)則分布的 齒狀突起帶 (denticle belt)， 這些突起帶的形狀和大小具有體節(jié)特異性 ， 這些是研究果蠅胚胎前一后軸和背 腹軸發(fā)育的重要表型依據(jù) 。 大約在 h胚帶開始回縮 ， 在這一過程中胚胎開始出現(xiàn)明確的 體節(jié) ， 包括 3個頭部體節(jié) ， 3個胸部體節(jié) ， 8個腹部體節(jié)和 1個尾節(jié) . 果蠅胚胎大約在受精后 24 h孵出成為幼蟲 。 副體節(jié)與后來的體節(jié)在位置上并不對應(yīng) ， 每一體節(jié)包含前一副體節(jié)的后 2/3與后一副體節(jié)的前 1/3。 到胚帶延伸完成時 ， 胚帶開始出現(xiàn)分節(jié) 。 在中腸細(xì)胞內(nèi)陷時 ， 在其前后部 同時帶人一部分外胚層細(xì)胞內(nèi)陷 ， 分別形成前腸和后腸 。 位于 外胚層最腹側(cè)的 預(yù)定神經(jīng)母細(xì)胞逐漸陷入胚胎內(nèi)部 ， 發(fā)育為神經(jīng)組織 。 而 集中于胚胎腹側(cè)的細(xì)胞帶 稱為 胚帶(germ band)。 隨著中胚層組織的內(nèi)陷 ， 原來位于胚胎背側(cè)的細(xì)胞也逐漸向腹側(cè)遷移集中 。 隨后這部分細(xì)胞與表層組織分離 ， 形成 中胚層管 。 在早期階段 ， 合子核進(jìn)行一系列快速分裂 ， 而胞質(zhì)不分裂 ， 形成 合胞體 (syncytium).核第 8次分裂 后 ,在胚胎最后部的核最先被細(xì)胞膜分隔形成 極細(xì)胞 ， 將形成生殖細(xì)胞 。 果蠅在 25 0C下 由卵至成蟲約需 11天 ， 經(jīng)過卵 、 幼蟲 、 蛹和成蟲 4個階段 。 果蠅為雙翅目昆蟲 ， 個體小 ， 生命周期短 ， 繁殖容易 ， 操作簡便 ， 成本低廉 ， 其 胚胎和成體都具有豐富的表型特征 。 但作為發(fā)育生物學(xué)研究模型 ， 在早期并未受到重視 。 隨后原條回縮 ,胚胎開始出現(xiàn)神經(jīng)板 、 脊索 、 體節(jié)等 。 而位于 內(nèi)部的內(nèi)胚團(tuán)細(xì)胞與雞胚的上胚層相當(dāng) .卵柱中央的腔將來成為羊膜腔 . 在 時 ， 在 上胚層 一側(cè)出現(xiàn) 原條 , 原條向前延伸 ， 其前端出現(xiàn)原節(jié) (node.)。 時胚泡到達(dá)子宮從透明帶中孵出并植入子宮壁 。 最大 缺點(diǎn)是其胚胎在母體內(nèi)發(fā)育，胚胎個體很小，很難實(shí)驗(yàn)操作 . 小鼠成熟卵外包被 透明帶 (zona pellucida )， 受精和卵裂均在輸卵管內(nèi)進(jìn)行 .在 8細(xì)胞時 胚胎發(fā)生緊密化 (paction)形成實(shí)心球體 ，至 32細(xì)胞時稱 桑椹胚 (morula).此后出現(xiàn) 囊胚腔 .胚胎分化為 滋養(yǎng)外胚層 (trophectoderm )和 內(nèi)細(xì)胞團(tuán) (inner cell lPass)— 胚泡 (blastocyst)。其 基因組測序已經(jīng)完成 ，遺傳學(xué)背景較為清楚， 相應(yīng)的遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)手段如轉(zhuǎn)基因、基因敲除等也比較完善 。 卵黃囊為胚胎的發(fā)育提供營養(yǎng) ，而尿囊是胚胎的呼吸器官并貯存代謝廢物 。 隨后原條開始逐漸回縮 ， 胚胎開始出現(xiàn)脊索 、 體節(jié) 、 神經(jīng)板等結(jié)構(gòu) 。 上胚層后部細(xì)胞向中間遷移 ， 使中央部分加厚形成 原條 ， 原條逐漸向前延伸 ， 其最前端細(xì)胞變得更密集 ， 稱為 亨氏結(jié) (Hensen‘s node)。 受精卵經(jīng)卵裂形成 胚盤 ， 胚盤中央逐漸與卵黃分離 ， 形成 胚下腔 。 雞卵在輸卵管內(nèi)完成受精 ， 在排卵過程中逐漸包被上卵清 、 殼膜和蛋殼 。 雞胚是 研究附肢 、 體節(jié)等器官發(fā)育機(jī)制的重要模型 。斑馬魚胚胎在受精后 48 h左右開始孵化為自由游動的幼體。到原腸作用結(jié)束時 ,卵黃細(xì)胞被完全包被在胚胎內(nèi)部。 到囊胚期 ，這些細(xì)胞與卵黃細(xì)胞融合 ， 形成一個合胞體層 ， 稱為 卵黃合胞體層 (yolkl syncytial layer， YSL)。 早期的卵裂為 盤狀不完全卵裂 ， 囊胚期胚胎形成一個細(xì)胞球位于卵黃上 ， 而囊胚腔并不明顯 。 斑馬魚作為發(fā)育生物學(xué)模式生物有兩個明顯的優(yōu)勢： 一是世代周期短 (約 3個月 ) ， 二是胚胎透明 ，易于觀察，同時 飼養(yǎng)管理較為簡單，容易進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn) 。 此次篩選成為斑馬魚研究領(lǐng)域的里程碑 。 ：斑馬魚 (Danio rerio) 20世紀(jì) 60年代 ， 美國 Oregon大學(xué) Streisinger G就開始了對斑馬魚的研究 。 目前 X. tropicalis的基因組測序已接近完成 。 X. tropicalis的卵直徑 mm，足以進(jìn)行顯微操作實(shí)驗(yàn) 。 與 X. laevis相比 ， X. tropicalis個體較小 ， 世代周期短 (約 4個月 ) ， 是二倍體品種 ， 因而比較適于進(jìn)行遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn) 。 主要是由于其 生命周期過長 ， 同時 ，X. laevis是異源四倍體 ， 多數(shù)基因都存在 4個拷貝 ， 很難進(jìn)行遺傳突變實(shí)驗(yàn) 。 幼體要生長 1 2年才能達(dá)到性成熟 。 在這一過程中原來位于植物半球的背部決定因子被轉(zhuǎn)運(yùn)至精子人卵處的對側(cè) ， 即未來胚胎的背側(cè) 爪蟾 胚胎經(jīng)過卵裂 、 囊胚 （ h） 、 原腸胚 (11 h)、 神經(jīng)胚 (18 h)及尾芽期 (25 h)等階段孵化成為幼蟲 (66 h)。 受精時精子于動物半球的任意位點(diǎn)人卵 。 非洲爪瞻的 成熟卵子具有明確的動物極和植物極 之分 。 早期胚胎發(fā)育很快 ，在 24oC下 受精后 2 天 左右就可以孵化為可自由游動的幼蟲 .非洲瓜蟾的研究為我們認(rèn)識脊椎動物的發(fā)育機(jī)制做出了重要貢獻(xiàn)。只需要注射激素，雌體第 2天 就可產(chǎn)卵 產(chǎn)卵量大 ,卵可通過人工授精獲得受精卵 。在 20世紀(jì)早期，常用的動物是 蠑螈和蜥蜴 ， 50年代以后，非洲爪瞻逐漸成為主要兩棲類動物模型。 上述物種中果蠅 、 線蟲和斑馬魚均可用于大規(guī)模遺傳突變研究 ， 小鼠的基因敲除技術(shù)已相當(dāng)完善 ， 非洲爪瞻的轉(zhuǎn)基因技術(shù)較有優(yōu)勢 。 胚胎一般較大 ， 相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)如顯微注射等比較完善 。 在實(shí)驗(yàn)室條件下 ， 這些動物常年可產(chǎn)卵 ， 隨時可獲得胚胎材料 ， 飼養(yǎng)管理簡單 ， 維持費(fèi)用低 。 對于發(fā)育分子機(jī)制的認(rèn)識也主要來源于對這些模式生物的研究 。 為回 答發(fā)育的遺傳程序是以何種方式編碼在基因組 DNA上 ， 編碼在 DNA上的遺傳信息又如何控制生物體的發(fā)育等 問題 ， 人們開始采用分子生物學(xué)方法和各種新興的生物學(xué)技術(shù) ， 進(jìn)行發(fā)育機(jī)制的研究 . 目前對于 果蠅和線蟲發(fā)育的分子控制機(jī)制已基本闡明 。 發(fā)育受遺傳程序的控制 ， 遺傳特性通過發(fā)育展現(xiàn)出來 . （五）分子生物學(xué)和發(fā)育生物學(xué) 發(fā)育生物學(xué)是個新興學(xué)科 。 基因通過其編碼產(chǎn)物 — 蛋白質(zhì)的變化控制發(fā)育分化中細(xì)胞的性質(zhì)和習(xí)性 .遺傳和發(fā)育是個體發(fā)生過程的兩個方面 。 所以 發(fā)育實(shí)際上看作是基因型與表型的結(jié)合 . 發(fā)育受遺傳信息的控制 ， 在發(fā)育過程中合子從雙親獲得的遺傳信息是如何表達(dá)的 ， 一個單細(xì)胞的合子又是如何發(fā)育成為具有功能的有機(jī)體的 ， 要回答這些難題 ， 需要將 遺傳學(xué)和胚胎學(xué)的研究結(jié)合 起來 。 由基因型控制發(fā)育 ， 同時有機(jī)體的表型又受到環(huán)境因子與基因型的共同影響 。 （ 四 ） 胚胎學(xué)和遺傳學(xué)的結(jié)合 Boveri (1902)對海膽的研究發(fā)現(xiàn) ， 正常的胚胎發(fā)育決定于正常的染色體組型 .之后的研究進(jìn)一步提出 基因型 (genotype)與表型 (phenotype)