【正文】 chnique ? 一 .高效液相色譜法的建立 87 – What is the sample ? – Concentration of the interested ponent – Contaminant – Characteristics of the sample – Structure – Molecular weight – pKa – Solubility 88 溶于水 ——排阻色譜 ， 水為流動相 相對分子質(zhì)量 ＞ 2022 不溶于水 ——排阻色譜 ， 非水流動相 同系物 ——分配色譜 不溶于水 異構(gòu)體 ——吸附色譜 樣品 分子大小差異 ——排阻色譜 反相液一液色譜 相對分子質(zhì)量 溶于水 ， 不離解 ＜ 2022 排阻色譜 ， 水為流動相 堿 ——陽離子交換色譜 溶于水 ， 可離解 酸 ——陰離子交換色譜 溶于水， 離子與非離子 —反相離子對色譜 89 2. 選擇合適的分析方法 – Analytical technique 187。 ? 柱子可反復(fù)使用 ——用一根色譜柱可分離不同的化合物 。 ? 分辨率高 ——可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果 。同時消耗樣品少 。 在一根柱中同時分離成份可達(dá) 100種 。 ? 高速 ——流速為 ~ ml/min。洗脫強(qiáng)度與極性參數(shù)、介電常數(shù)同時相關(guān) ? 離子強(qiáng)度 ：反相中，離子強(qiáng)度增加，溶質(zhì) k下降 79 4. 應(yīng)用 有機(jī)酸 、 有機(jī)堿特別是強(qiáng)酸 強(qiáng)堿的分析 ， 如羧酸 、 磺酸 、 胺類 、 酚類 、 藥物 、 染料等 反相離子對色譜分析有機(jī)酸 固定相： C18烷基鍵合相 流動相： +戊醇 1. 4氨基苯甲酸； 2. 3氨基苯甲酸；3. 4羥基苯甲酸； 4. 3羥基苯甲酸；5. 苯磺酸； 6. 苯甲酸； 7. 甲苯 4磺酸 80 色譜類型 （ Mode） 固定相 （ Stationary Phase） 流動相 (Mobile Phase) 主要適用范圍 (Compound Sepatated) 正相色譜 （ NormalPhase） 硅膠 、氰基、氨基 有機(jī)溶劑 在水中絕對不溶解的物質(zhì)或同分異構(gòu)體 反相色譜色譜 (ReversedPhase) C18,C8,C4,C2 水 /有機(jī)溶劑 中性、弱酸性、弱堿性物質(zhì) 離子對色譜 (IonPair) C18,C8 水 /有機(jī)溶劑 離子對試劑 離子 離子交換色譜 (Ion Exchange) 陰離子和陽離子交換劑 水相 /緩沖鹽 對離子 離子 體積排阻色譜 (Size Exclusion) 聚酯、硅膠 水相 (GPC) 有機(jī)相 (GPC) 大分子量化合物 聚合物 液相色譜常用類型總結(jié)： 81 第 3章 高效液相色譜法的建立與應(yīng)用 82 我國藥典收載高效液相色譜法項目和數(shù)量比較表： 83 高效液相色譜儀的分析原理 ? 高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu) ? 色譜柱在高效液相色譜儀中的作用和峰形產(chǎn)生原理 高壓泵 進(jìn)樣器 檢測器 色譜工作站 色譜柱 84 HPLC有以下特點 ? 高壓 ——壓力可達(dá) 150~300 Kg/cm2。 ? 離子對試劑的性質(zhì)與濃度 ：反相中，離子對試劑烷基鏈越長，疏水性越大， k越大。多為反相離子對色譜 75 76 77 2. 固定相、流動相和離子對試劑 ? 固定相 多為 C18,C8反相鍵合相 ? 流動相 是以水為主的緩沖液 ， 或水 甲醇 、 水 乙腈等混合溶劑 ? 離子對試劑 ：四丁基銨正離子 、 十六烷基三甲基銨正離子 ， ClO4， 十二烷基磺酸根等 78 3. 影響保留值的因素 ? pH的影響 ： 改善分離選擇性的有效方法。 69 5 應(yīng)用 70 二 .液固色譜法 Liquid Solid Chromatography 1. 固定相 極性： 硅膠 、氧化鎂、氧化鋁等 非極性：活性炭、高分子多孔微球、碳多孔微球等 2. 流動相 硅膠為固定相時：以弱極性的正構(gòu)烷烴為主體，加入二氯甲烷等中等極性溶劑調(diào)節(jié)合適的洗脫強(qiáng)度。 ? pH值： – 加入酸、堿或緩沖液，控制 PH，抑制溶質(zhì)的離子化，改善峰形。無機(jī)鹽使流動相表面張力增大，對非離子性溶質(zhì)，使 k增加，對離子型溶質(zhì)， k下降。其斥力越大，溶質(zhì)與固定相鍵合越強(qiáng)，保留值越大。 65 66 ? 烷基鍵合固定相特性對保留值的影響： – 反相：鍵合相烷鏈長， k大，選擇性好。 64 4. 影響保留值的因素 ? 溶質(zhì)結(jié)構(gòu)對保留值的影響： – 正相：溶質(zhì)極性越強(qiáng)，官能團(tuán)越多，保留值越大 – 反相：溶質(zhì)極性越弱，疏水性越強(qiáng)，保留值越大。溶于水的高極性化合物、中等極性化合物 C8 反相、離子對 與 C18類似，保留值略小 C3,C4 反相 保留值小，適合肽類和蛋白質(zhì) 苯基 反相 保留適中，選擇性不同。 應(yīng)用最廣泛 58 正相色譜法與反相色譜法比較表 正相色譜法 反相色譜法 固定相極性 高～中 中～低 流動相極性 低～中 中～高 組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出 59 2. 固定相 ? 疏水基團(tuán) 如不同鏈長的烷烴（ C8和 C18）和苯基等 ? 極性基團(tuán) 如氨丙基 ， 氰乙基 、 醚和醇等 。 即配制一個與被測組分含量十分接近的標(biāo)準(zhǔn)溶液 ，定量進(jìn)樣 ， 計算被測物的含量 。 該法必須定量進(jìn)樣 。 53 ? 外標(biāo)法（標(biāo)準(zhǔn)曲線法） ?用于常規(guī)分析 ?優(yōu)點： 操作簡單 ， 計算方便 。(Ai/As)，以Ci%對 Ai/As作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 ?缺點： 每次分析必須準(zhǔn)確稱量被測物和內(nèi)標(biāo)物 ， 不適合于快速分析 。 ssiisiAfAfmm ?1001001100% , ?????????? sississsiiii fmmAAmAfmAfmmC單點校正 51 ?適用范圍： 當(dāng)只需測定試樣中某幾個組分，且試樣中所有組分不能全部出峰時可用。 ?缺點 ： 對該法的苛刻要求限制了它的使用 。 1ii fS ?被測組分的質(zhì)量 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量 分子量 46 ? 定量方法 ? 校正歸一化法 —— 含歸一化 ? 內(nèi)標(biāo)法 —— 含內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法 ? 外標(biāo)法 —— 含單點校正 47 ? 校正歸一化法 1 0 01 0 01 0 0%221121??????????????????nniiniiifAfAfAfAmmmmmmC?推導(dǎo) ： %1 0