【正文】 utoff值計(jì)算：平均標(biāo)準(zhǔn)校正值 X 校止因子 4． ISR 值：免疫狀況比率， 0D 標(biāo)本 cutoff值。l l00181。l l00181。l l00181。l l00181。l l00181。l l00181。l 標(biāo)準(zhǔn)校正 l00181。l 陽(yáng)性對(duì)照 l00181。l )，混用。 【方法】 1．血清處理：稀釋試驗(yàn)血清、標(biāo)準(zhǔn)校正液和陰陽(yáng)性質(zhì)控液 1： 21(10181。 ⑧底物。 ⑥酶標(biāo)結(jié)合物。 ④陰性質(zhì)控液。 ②血清稀釋液。 衣原體抗體測(cè)定 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) 【原理】 沙眼衣原體屬特異性抗原 (LPS)包被酶標(biāo)板，與血清中衣原體抗體反應(yīng)后，再通過(guò)與酶標(biāo)抗衣原體抗體結(jié)合，形成抗體一抗原一酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)底物顯色證明衣原體抗體的存在。結(jié)果陽(yáng)性表示病人可能有衣原體感染 ，但需結(jié)合臨床癥狀全面考慮。 4．嚴(yán)格按照要求觀察結(jié)果，注意鑒別非特異性沉淀線(xiàn)。用于男性尿道標(biāo)本，結(jié)果解釋?xiě)?yīng)慎重。 【注意事項(xiàng)】 第 22 頁(yè) 共 111 頁(yè) 1． 質(zhì)控試驗(yàn)：陽(yáng)性和質(zhì)控物 5 滴于采集管，測(cè)定同標(biāo)本。 結(jié)果窗出現(xiàn)一條黑線(xiàn)，表明試驗(yàn)陽(yáng)性 ； 如無(wú)，試驗(yàn)陰性。 3． 檢測(cè)：滴加 5 滴標(biāo)本提取物于試驗(yàn)板的檢測(cè)窗，靜置 15min，讀取結(jié)果。 標(biāo)本置于運(yùn)送培養(yǎng)基中， 24h 接種，超過(guò) 24h 應(yīng)置于低溫冰箱保存。 女性：宮頸管內(nèi) l~2 厘米處取材，或尿道取材。 5． 標(biāo)本采集管。 3． 陰性質(zhì)控物。質(zhì)控窗含有抗衣原體抗體，無(wú)論是否形成抗原抗體復(fù)合物，均在質(zhì)控窗形成衣原體抗體一抗該抗體復(fù)合物，黑色沉淀線(xiàn)。 （ 4）放線(xiàn)菌酮的濃度應(yīng)事先摸索，濃度大對(duì)衣原體的生長(zhǎng)有影響。 （ 2）配置培養(yǎng)基的試劑的 來(lái)源、批號(hào)、用量及配置方法應(yīng)保存好以便追溯問(wèn)題的來(lái)源。 【結(jié)果】 碘染色包涵體染成深棕色；姬姆薩染色包涵體染成深 藍(lán) 色。將已接種標(biāo)本的微量板在 35℃、 3000g 離心 1h，棄去標(biāo)本液，每孔加入 分離培養(yǎng)液 ,培養(yǎng) 48h 觀察結(jié)果 . 3．觀察結(jié)果： （ 1）碘染色方法：吸去微量板孔中的培養(yǎng)液加 甲醇于培養(yǎng)孔中 ,固定 10min,棄取甲醇加 碘染色液 ,染 15min 后棄去染色液 ,加 1 滴封固液于潔凈玻片上 ,將蓋玻片從孔中取出 ,細(xì)胞面向下 ,放于封固液上顯微鏡下觀察。微量板孔中預(yù)先放入一直徑為 形蓋玻片 ,細(xì)胞即可在此玻片上生長(zhǎng)， 5%CO 36℃培養(yǎng) 48h，使蓋玻片上長(zhǎng)成細(xì)胞單層。加胰蛋白酶 EDTA 液消化單層，室溫中孵育 2~3min，讓細(xì)胞完全離散，加培養(yǎng)液吹打細(xì)胞使之混懸。繼續(xù)培養(yǎng) 2~3 天，直至細(xì)胞融合成單層。 【方法】 1． McCoy 細(xì)胞單層的制備：將 McCoy 細(xì)胞從液氮中取出，置 37℃水浴中迅速 第 20 頁(yè) 共 111 頁(yè) 融化。g /ml，制霉菌素 25U/ml,HEPES10mmol/L,L谷氨酰胺2mmol/L,用碳酸氫鈉調(diào)節(jié) pH 至 ； （ 2）標(biāo)本運(yùn)送液：每 1000ml 細(xì)胞培養(yǎng)液另加葡萄糖 ； （ 3）分離培養(yǎng)液：細(xì)胞培養(yǎng)液另加放線(xiàn)菌酮，濃度為 1181。 【 材料】 （ 1）細(xì)胞培養(yǎng)液：每 1000ml 中含 RPMI1640 ，新生牛血清 10%，慶大霉素 10181。選用的細(xì)胞為衣原體感染的敏感細(xì)胞，使用化學(xué)物質(zhì)或輻射處理細(xì)胞，并用離心方法使衣原體接種物易于進(jìn)入細(xì)胞。 沙眼衣原體細(xì)胞培養(yǎng) 【原理】 沙眼衣原體是專(zhuān)性細(xì)胞內(nèi)寄生的微生物，它自身不能產(chǎn)生能量，依賴(lài)于宿主細(xì)胞提供。由于 70%～ 80%的女性和多達(dá) 50%的男性常表現(xiàn)為無(wú)臨床癥狀的 感染，所以實(shí)驗(yàn)室診斷具有重要作用。 7． 每次試驗(yàn)最好用已知的陽(yáng)性菌株和陰性菌株作對(duì)照。 3．碘液如產(chǎn)生沉淀應(yīng)新配制。在 100ml,蒸餾水中加入 1g可溶性淀粉，放到開(kāi)水中水浴直到淀粉溶解。但即使這樣，保存時(shí)間也不宜太長(zhǎng)。 【注意事項(xiàng)】 1．由于青霉素溶液很易分解，因而用于試驗(yàn)的青霉素溶液應(yīng)新鮮配制。觀察結(jié)果。 5．加入碘液 。 3．在 37℃水浴中放置 30min，不時(shí)搖動(dòng)，使酶能破壞青霉素。取 于一小試管中。 碘量法（β 內(nèi)酰胺酶測(cè)定） 【原理】 β 內(nèi)酰胺酶能裂解青霉素的β 內(nèi)酰胺環(huán)形成青霉噻唑酸，它與淀粉競(jìng)爭(zhēng)游離碘 , 破壞了碘和淀粉的藍(lán)色復(fù)合物，使 藍(lán) 色變?yōu)闊o(wú)色。 第 17 頁(yè) 共 111 頁(yè) 【結(jié)果】 產(chǎn)酶菌株分解青霉素產(chǎn)生青霉噻唑酸使培養(yǎng)基 pH 值降低，顏色由紅變黃。 2．用接 種環(huán)刮取菌苔涂于青霉素瓊脂上，約綠豆大小。檢查瓊脂是否充分溶解，冷卻到 50℃， pH 值 ，以無(wú)菌手續(xù)加人青霉素 (600mg)10支 (每支先用 4ml 蒸餾水溶解 )充分混勻后倒平皿，每 65mm 的平皿倒入 13ml。該酶能分解青霉素，使培養(yǎng)基的 pH 值降低，培養(yǎng)基顏色發(fā)生改變。此外，還有由染色體突變而產(chǎn)生的耐青霉素菌株，它不產(chǎn)生青霉素酶。如對(duì)青霉素在耐藥范圍的淋球菌菌株不一定全是 PPNG 菌株。所獲資料可作為對(duì)當(dāng)?shù)亓餍芯昴退帨y(cè)定的依據(jù)。 5．應(yīng)用世界衛(wèi)生組織 A、 B、 C、 D、 E 五株參考菌株作質(zhì)控。 3．根據(jù)當(dāng)?shù)啬退幩降臐舛确秶?，選擇制備平板中抗生素的含量。 【注意事項(xiàng)】 1．抗生素應(yīng)為純品，應(yīng)川精密天平稱(chēng)量。此數(shù)值也即該藥對(duì)此菌的最小抑菌濃度（ MIC）。常用 181。同常規(guī)法培養(yǎng)，次日判定結(jié)果。l ～ 2181。 3． 用接種環(huán)刮下菌苔，用 MH 肉湯制成 1 107/ml 的懸液。 【方法】 1． 精確稱(chēng)取純品抗生素，溶于合適的溶劑中，用蒸餾水稀釋后加到培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中藥物的濃度由少到多逐倍遞增。若對(duì)本地區(qū)菌株進(jìn)行系統(tǒng)耐藥監(jiān)測(cè)，則應(yīng)用瓊脂稀釋法測(cè)定每年菌株的 MIC。但紙片法受多種 第 15 頁(yè) 共 111 頁(yè) 因素影響，結(jié)果常不夠穩(wěn)定，不少學(xué)者認(rèn)為，本試驗(yàn)的目的主要是用以指導(dǎo)治療。 （ 6） 紙片應(yīng)在有效期內(nèi)使用，已到失效期的紙片應(yīng)扔掉。當(dāng)干燥指示劑變色時(shí)應(yīng)及時(shí)更換以免過(guò)潮。 （ 4） 當(dāng)使用 — 種特殊的紙片分配器時(shí)，必須將其蓋緊，并附有指示性干燥劑。 （ 2） 為了保持紙片的藥效，β 內(nèi)酰胺族的含藥紙片需要凍存，少量因工作需要的可在冷藏條件下保存到 — 周。 7．用于敏感性試驗(yàn)的含藥紙片，一般需分開(kāi)裝瓶，包裝中須確保防潮。在明顯的抑菌圈內(nèi)有大菌落生長(zhǎng)時(shí)應(yīng)對(duì)它傳代培養(yǎng)，重新鑒定，并重新試驗(yàn)。測(cè)量最小達(dá)毫米水平，用游標(biāo)卡、普通尺或特殊的模板來(lái)讀取結(jié)果。由于某些藥物的擴(kuò)散極快，紙片一旦貼到平皿上就不要再移動(dòng)。所用肉湯的 pH值應(yīng)在 ～ 。接種后蓋上平皿蓋放置 3min～5min，使多余的水分被吸干，然后再貼藥敏紙片。如培養(yǎng)皿涂布滿(mǎn)意且接種物正確，則抑菌圈為一致的圈形，菌在平皿中為融合生 第 14 頁(yè) 共 111 頁(yè) 長(zhǎng)。每次將平皿旋轉(zhuǎn) 60176。有些試驗(yàn)裝置可使接種物直接標(biāo)準(zhǔn)化而不需調(diào)整。 3． 應(yīng)使用培養(yǎng) 18h～ 24h 的菌落制成懸液并立即將懸液調(diào)至 1 108/ml 的濃度。 2． 雖然 MH 瓊脂用于敏感性試驗(yàn)一般來(lái)說(shuō)是可靠的，但偶爾在某些批號(hào)間有顯著差異。g ＜＝ 31 【注意事項(xiàng)】 1． 目前用于治療淋病的藥物可分為 7 大類(lèi)，每類(lèi)藥中只要選一種為代表試驗(yàn)，其敏感程度即可代表其他同類(lèi)藥的敏感性。g ＜＝ 19 環(huán)丙氟哌酸 5181。g ＜＝ 35 壯觀霉素 100181。參照標(biāo)準(zhǔn)報(bào)告結(jié)果。 5． 培養(yǎng) 16h～ 18h(也可 24h)觀看結(jié)果。每個(gè) 90mm 的平皿可均勻貼 7 張紙片。 4． 用無(wú)菌鑷子將各種藥物紙片緊貼于培養(yǎng)基表面。 3． 用滅菌棉拭蘸取菌液均勻涂布于培養(yǎng)基表面，待干。 2． 刮取菌苔洗于 MH 肉湯中，振蕩，獲得均勻的菌液。 【方法】 1． 用無(wú)選擇性培養(yǎng)基 (如巧克力培養(yǎng)基 )再次分離淋球菌。瓊脂中藥物濃度與紙片距離成反比，距紙片越遠(yuǎn)藥物濃度越小。 KB 法抗生素藥敏試驗(yàn) 【原理】 將含藥紙片貼到涂有淋球菌的培養(yǎng)基上，藥物即擴(kuò)散到瓊脂中。另外由于目前已制成抗淋球菌蛋白工、Ⅱ和Ⅲ型的單抗，用它制成不同血清型的協(xié)同凝集試劑，因此，本試驗(yàn) 第 12 頁(yè) 共 111 頁(yè) 也可用于淋球菌的初步血清學(xué)分型。陰性結(jié)果強(qiáng)烈提示試驗(yàn)不是淋球菌。陽(yáng)性對(duì)照液是一瓶特異的淋球菌純培養(yǎng)提純物。試驗(yàn)物干時(shí)結(jié)果會(huì)受干擾。 4．為使結(jié)果易于觀 察，可將試劑 (金黃色葡萄球菌 )染成藍(lán)色。 3．制備菌懸液時(shí)，鹽水的酸堿度頗為重要，通常要求 pH 值在 ~ 之間。特異性強(qiáng)的單抗，可用來(lái)區(qū)別淋球菌和腦膜炎球菌、干燥奈瑟菌、微黃奈瑟菌、淺黃奈瑟菌、粘液奈瑟菌和粘膜炎布蘭漢球菌。即使本試驗(yàn)陽(yáng)性，臨床醫(yī)生也不應(yīng)僅根據(jù)單一的試驗(yàn)來(lái)作出診斷，而應(yīng)綜合臨床和實(shí)驗(yàn)室資料后謹(jǐn)慎作出。因此，一般用作可疑菌的鑒定，作進(jìn)一步確診用。 以 2+以上為試驗(yàn)陽(yáng)性。 【結(jié)果】 所檢菌與試劑起凝集反應(yīng)者為陽(yáng)性，和本試劑無(wú)反應(yīng)者為陰性。每種試劑各用一新環(huán)。菌懸液在加之前需充分混勻。 3．在試驗(yàn)紙片上加試劑和陰性對(duì)照液各 1 滴。在沸水中水浴 5min。 【方法】 1．將已經(jīng)初步診斷為淋球菌的菌落，接種于培養(yǎng)基中，于 35℃ ~7℃ (含 5%~7% 二氧化碳的潮濕環(huán)境中 )培養(yǎng) 16h~24h。為未 免疫家兔的血清，也已結(jié)合于滅活的金黃色葡萄球菌上 ,作陰性對(duì)照用。為抗淋球菌抗原的小鼠單克隆抗體 (1A 和 1B)，已結(jié)合在滅活的金黃色葡萄球菌上。因此，挑選金黃色葡萄球菌的某些菌株 (有市售 )，與淋球菌特異性膜蛋白的小鼠單克隆抗體作用 (致敏 )，然后用其來(lái)檢查待檢株，如是淋球菌，則淋球菌菌體抗原和吸附于金黃色葡球菌上的抗淋菌單克隆抗體起作用，單抗又結(jié)合著金黃色葡萄球菌，從而產(chǎn)生凝集反應(yīng)，如待檢菌不是淋球菌，則不產(chǎn)生凝集反應(yīng)，試驗(yàn)為陰性。確證和區(qū)別其它 奈 瑟氏菌。如將糖發(fā)酵管放到 37℃ 水浴中，則看結(jié)果的時(shí)間可縮短。 6． 使用胱氨酸胰酶瓊脂（ CTA）作糖發(fā)酵試驗(yàn)時(shí)，可用接種針將菌種入培養(yǎng)管的上 1/3。個(gè)別菌株可培養(yǎng)過(guò)夜后讀結(jié)果。 4． 現(xiàn)已有一些滿(mǎn)意的商品化糖發(fā)醇試驗(yàn)，如 Minitek（ BBL 公司）。 3． 應(yīng)該使用 18h~24h 的淋球菌培養(yǎng)物。 2． 用作試劑的菌要純。最好用進(jìn)口的分析純?cè)噭?。其他糖管顏色不變? 第 9 頁(yè) 共 111 頁(yè) 【結(jié)果】 淋球菌發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵其他糖。 4．每管加 菌懸液，充分混勻。第 5 管不加糖 (對(duì)照管 )。過(guò)濾滅菌后儲(chǔ)存于 4℃冰箱備用。挑取培養(yǎng) 18h~24h 的純菌 2 滿(mǎn)環(huán) (直徑 3mm)混懸于 ~ 緩沖平衡鹽指示溶液 (BSS)中，制成濃濁菌懸液。 確證鑒定試驗(yàn) 糖發(fā)酵試驗(yàn) 【原理】 淋球菌有分解葡萄糖的酶類(lèi)，當(dāng)它分解葡萄糖時(shí)產(chǎn)酸，使培養(yǎng)基的 pH 值降 低，因而培養(yǎng)基中的指示劑顏色改變，如酚紅由紅變黃，溴甲酚紫由紫變黃。標(biāo)本涂片菌體形態(tài)符合淋菌特征，培養(yǎng)長(zhǎng)出淋菌菌落，加上氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性，即可做出初步診斷，開(kāi)始治療。菌落一旦變黑，多數(shù)菌即告死亡。所以，在測(cè)定杜克雷菌等氧化酶試驗(yàn)弱陽(yáng)性的菌株時(shí)，最好用前者。 2．氧化酶試劑遇鐵也會(huì)出現(xiàn)紅色而造成假陽(yáng)性，所以操作用的接種環(huán)應(yīng)避免用舊鐵絲或電爐絲等制成．并在每次試驗(yàn)前先檢查是否末挑茵的接種環(huán)接觸試劑就有紅色出現(xiàn)。如果試劑買(mǎi)來(lái)時(shí)已成灰色或黑色，說(shuō)明已失效而不應(yīng)使用。 【注意事項(xiàng)】 1．為了保證育良好的反應(yīng)，所用氧化酶試劑不應(yīng)過(guò)分陳舊。 3．或先滴一滴試劑于濾紙條上 (勿太濕 )，再涂菌落，觀察顏色變化。 【方法】 1．在混有雜菌的淋球菌分離平皿上滴加氧化酶試劑后變成紫紅色的菌落為氧化酶試驗(yàn)陽(yáng)性。 氧化酶試驗(yàn) 【原理】 淋球菌在生長(zhǎng)過(guò)程中產(chǎn)生氧化酶。 2． 陳舊的培養(yǎng)物，涂片顏色結(jié)果不典型，應(yīng)取新鮮培養(yǎng)物。與分泌物涂片所見(jiàn)不同，此涂片中無(wú)白細(xì)胞。菌體為 大