酶分子修飾ppt課件-文庫(kù)吧資料
2025-01-14 05:36本頁(yè)面
【正文】 ， 確定欲置換的核苷酸 （ 或氨基酸 ） 的位置 。是指在 DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù) 。 （ 一 ） 、 氨基酸置換修飾的方法 化學(xué)修飾法 化學(xué)修飾難度大 、 成本高 、 專一性差 ，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾 ， 操作復(fù)雜 ， 難以工業(yè)化生產(chǎn) 。 LIVS的 5‘端切除 15nt后環(huán)化 ， 開(kāi)環(huán)后進(jìn)行第二次環(huán)化 ， 又失去 4nt， 最后開(kāi)環(huán)得到一個(gè)在 5’端失去 19個(gè)核苷酸的多功能核酸類酶 L－ 19 IVS。 通過(guò)修飾可以使某些酶顯示出催化活性 。 例如：木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶進(jìn)行有限水解 ， 除去其肽鏈的 2/3， 該酶的活力基本保持 ， 其抗原性卻大大降低 。 ② 提高酶的活性： 例如：從羧基端切除 10個(gè)氨基酸殘基的肽段 ， 可以使天冬氨酸酶的活力提高 5倍左右 。 修飾劑的選擇：一般為專一性較高的蛋白酶或肽酶 。（） 。 酶分子側(cè)鏈修飾的意義 了解溶液狀態(tài)下的酶分子的構(gòu)象 研究某種基團(tuán)在酶分子中的作用 測(cè)定某一種基團(tuán)在酶分子中的數(shù)量 提高酶的活力、增加酶的穩(wěn)定性、降低酶的抗原性 獲得新的酶種 （） （） ，而且修飾之后 的酶分子可用熒光檢測(cè)。 通過(guò)分子內(nèi)交聯(lián)修飾 ， 可以使酶分子的空間構(gòu)象更為穩(wěn)定 ， 從而提高酶分子的穩(wěn)定性 。 修飾劑： N－溴代琥珀酰亞胺 （ NBS） 、 2－羥基－ 5－硝基芐溴 （ HNBB） 和 4－硝基苯硫氯 。 可以通過(guò)修飾得知分子中咪唑基的數(shù)量 。 常用的咪唑基修飾劑有碘乙酸 、 焦碳酸二乙酯等 。 酚基修飾的方法主要有碘化法 、 硝化法 、琥珀?；ǖ?。 酚基的修飾包括酚羥基的修飾和苯環(huán)上的取代修飾 。 它們可以在中性或者弱堿性的條件下與精氨酸殘基上的胍基反應(yīng) ， 生成穩(wěn)定的雜環(huán)類化合物 。 （四）、胍基修飾 采用二羰基化合物與胍基反應(yīng)生成穩(wěn)定的雜環(huán) ， 從而改變酶分子的空間構(gòu)象的方法稱為 胍基修飾 。 常用的巰基修飾劑 有?；瘎?、 烷基化劑 、馬來(lái)酰亞胺 、 二硫蘇糖醇 、 巰基乙醇 、 硫代硫酸鹽 、 硼氫化鈉 。 用此修飾法可以定量測(cè)定酶分子中羧基的數(shù)目 。 所使用的羧基修飾劑有：碳化二亞胺 、重氮基乙酸鹽 、 乙醇－煙酸試劑 、 異噁唑鹽等 。 這些氨基修飾劑作用于酶分子側(cè)鏈上的氨基 ，可以產(chǎn)生脫氨基作用或與氨基共價(jià)結(jié)合將氨基屏蔽起來(lái) 。 （ 一 ） 、 氨基修飾 采用某些化合物使酶分子側(cè)鏈上的氨基 （ － NH2)發(fā)生改變 ， 從而改變酶蛋白的空間構(gòu)象的方法稱為氨基修飾 。 RNA 分子上的側(cè)鏈基團(tuán)主要包括 磷酸基 ， 核糖上的羥基 、 嘌呤 、 嘧啶堿基上的氨基和羥基 （ 酮基 ） 等 。 ③ 各種大分子與酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)形成共價(jià)鍵而進(jìn)行大分子結(jié)合修飾 。 相應(yīng)的酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾可以采用 ① 各種小分子修飾劑 ， 例如 ， 氨基修飾劑 、 羧基修飾劑 、 巰基修飾劑 、 胍基修飾劑 、 酚基修飾劑 、 咪唑基修飾劑 、 吲哚基修飾劑等 。 酶 半衰期 天然 SOD 6min（血漿） 右旋糖酐 SOD 7h Ficoll（低分子量） SOD 14h Ficoll（高分子量） SOD 24h PEGSOD 35h 增加酶的穩(wěn)定性 三 、 酶分子的側(cè)鏈修飾 采用一定的方法使酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變 ， 從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法稱為 側(cè)鏈基團(tuán)修飾 。 通過(guò)修飾降低或消除酶蛋白的抗原性 例如：具有抗癌作用的 精氨酸酶 經(jīng) PEG結(jié)合修飾 ， 生成聚乙二醇－精氨酸酶后其抗原性消除；對(duì)白血病有顯著療效的 L－天冬酰胺酶 經(jīng)右旋糖苷或者聚乙二醇結(jié)合修飾后 ， 都可以使抗原性顯著降低甚至完全消除 。 通過(guò)修飾可以增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性 例如： SOD經(jīng)過(guò)大分子修飾 ， 其穩(wěn)定性顯著提高 ， 延長(zhǎng)70～ 350倍 （ 半衰期 6～ 30min） 。 分離 需要通過(guò)凝膠層析等方法進(jìn)行分離 ，將具有不同修飾度的酶分子分開(kāi) ， 從中獲得具有較好修飾效果的修飾酶 。 ④ 聚乙二醇氨類衍生物等： MPEG的羥基與胺類化合物反應(yīng) ， 生成的聚乙二醇胺類衍生物 ， 可以對(duì)酶分子上的 羰基 進(jìn)行修飾 。 可通過(guò)馬來(lái)酸酐對(duì)酶分子上的 氨基 進(jìn)行修飾 ， 形成酰胺鍵 。這些衍生物可以在 pH7~10的條件下對(duì)酶分子的氨基進(jìn)行修飾 。 后者分子上的活潑氯離子可以對(duì)天冬酰氨酶等酶分子上的氨基進(jìn)行修飾 。 近年來(lái)聚乙二醇的活化方法已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一 。 相對(duì)分子質(zhì)量為 1000～ 10000的 PEG被廣泛應(yīng)用 。 （ 一 ） 、 大分子結(jié)合修飾的方法 修飾劑的選擇 一般為水溶性大分子 。 二 、 大分子結(jié)合修飾 采用水溶性大分子與酶的側(cè)鏈基團(tuán)共價(jià)結(jié)合 ， 使酶分子的空間構(gòu)象發(fā)生改變 ， 從而改變酶的特性與功能的方法稱為大分子結(jié)合修飾 。 改變酶的動(dòng)
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