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植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)-文庫(kù)吧資料

2025-01-12 05:28本頁(yè)面
  

【正文】 管取出后 , 放在4℃ 冰箱中 , 看其是否凝固 , 如不凝固 , 則說明明膠分解而導(dǎo)致液化 , 為陽(yáng)性反應(yīng) 。 1) 接菌:采用穿刺法接菌后 , 放在適溫中培養(yǎng) 13周 。 2) 接菌:將細(xì)菌接種于試管中的培養(yǎng)液中后 , 用上述制備的濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間 , 使紙條懸在培養(yǎng)液面上 , 但不要碰到培養(yǎng)液 , 適溫培養(yǎng) 1周 。 3) 結(jié)果觀察:紙條變黑表示有硫化氫產(chǎn)生 , 為陽(yáng)性反應(yīng) 。 1) 接菌:在培養(yǎng)液中接菌后培養(yǎng) 1周 (二)氮素化合物的分解 2) GriessLlosvary試劑測(cè)定法 試劑 A : 對(duì) 氨 基 苯 磺 酸 , 5mol/L 醋酸( ) 1000ml 試劑 B:二甲基 α 萘胺 6ml, 5mol/L醋酸 1000ml 1) 醋酸鉛濾紙條的制備:將濾紙剪成 5mm 50mm的小條浸在 5%醋酸鉛溶液中 , 空氣中干燥后 , 在 120℃烘箱中滅菌 1h。 在 4h內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性反應(yīng) 。 2) 甲基紅試劑配制:甲基紅 300ml的 95%酒精中 , 然后用蒸餾水稀釋至 500ml。 ( 2 ) 配 制 過 程 : 將 NH4H2PO4 、 氯化鉀 、 , 調(diào)節(jié) 加入溴百里酚蘭 , 最后加入碳素化合物 ( 也可分別滅菌后加入 ) 3) MR試驗(yàn)結(jié)果觀察:取上述培養(yǎng)液 5ml, 加甲基紅試劑 2~3滴 , 呈明顯紅色為陽(yáng)性 , 呈黃色為陰性 。 有的細(xì)菌不產(chǎn)酸和氣 , 有的只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 , 少數(shù)植物病原細(xì)菌既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣 ( 3) 分裝:將上述培養(yǎng)基分裝于試管中 , 每管 10 mL左右 。 1%碳素化合物 。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法 (一)碳素化合物的利用 1) 接菌培養(yǎng):一般每 5 mL培養(yǎng)液接種 108 CFU/ml菌懸液 , 適溫下培養(yǎng) 34周 。 鑒定中有何作用 ? 為什么 ? , 在操作過程中也要注意動(dòng)作的輕柔 , 為什么 ? 3 觀察和記錄 NA平板上的細(xì)菌菌落性狀 、 菌體形狀 、 運(yùn)動(dòng)性和革蘭氏染色結(jié)果 。 ( 4) 媒染劑過濾后 , 直接將濾液滴在涂片上 , 處理 57分鐘 ( 5) 用水輕輕洗去染媒劑 , 甩去載玻片上剩余的水 ,在空氣中干燥后 , 再加苯酚品紅染劑染色 5分鐘 。 用吸管沿試管壁緩緩加入無菌水 5mL, 靜置 30分鐘左右 , 配成菌懸液 。 溶液 Ⅱ : 苯酚 ( 結(jié)晶 ) 5g, 蒸餾水 95mL ( 2) 染液: 2. 染色步驟 ( 1) 載玻片準(zhǔn)備:選用新的或沒有傷痕的 , 先用洗潔精浸泡洗滌 , 用清水洗凈后 , 再放入酸酒精 ( 硫酸與酒精等量混合 ) 中浸泡 2448h, 取出后用清水洗凈 ,再用蒸餾水洗 , 瀝干水后 , 浸泡在 95%酒精中備用 。 使用前用蒸餾水稀釋 2倍 , 染色時(shí)過濾 , 濾液直接滴在涂片上 。 2. 氫氧化鉀溶解試驗(yàn) ( 1) 試劑: 3% 氫氧化鉀 ( 2) 方法:取 1- 2滴 3% 氫氧化鉀溶液置于干凈的 玻片上 , 用牙簽取新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物與氫氧化鉀混合 ,充分?jǐn)嚢?10- 20秒 , 如果液滴變粘稠并可拉出絲狀物體 , 表示測(cè)試菌為革蘭氏陰性菌 , 反之則為革蘭氏陽(yáng)性菌 。 E. 用 95%酒精褪色約 30秒 。 C. 結(jié)晶紫染色 1分鐘 , 水洗數(shù)秒鐘 , 吸干 。 將 碘和碘化鉀在研缽中研和 , 慢慢加水并繼續(xù)研和直至碘和碘化鉀溶解 , 然后加水稀釋到 300mL, 盛入棕色試劑瓶 , 放暗處備用 。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作方法 (一)革蘭氏染色 ( 1) 試劑 A. 結(jié)晶紫草酸銨染劑: 溶液 Ⅰ : 結(jié)晶紫 , 酒精 ( 95%) 20mL 混合溶液 Ⅰ 和 Ⅱ , 過濾 , 貯藏于試劑瓶中 , 24h后使用 。 5. 結(jié)果觀察:在 24~ 48h表現(xiàn)枯斑為陽(yáng)性反應(yīng) ,3d左右出現(xiàn)黃斑為陰性反應(yīng) 。 用滅菌水作陰性對(duì)照 , 同屬HR陽(yáng)性的菌株作陽(yáng)性對(duì)照 。 1. 配制 107108CFU/mL的細(xì)菌懸浮液 , 菌齡 48小時(shí)左右; (二)致病性測(cè)定 2. 指示植物的選擇:一般用煙草 , 在假單胞和黃單胞菌屬上較適用 。 將冷卻至 45℃ 左右的培養(yǎng)基倒入裝有稀釋菌液的培養(yǎng)皿中,輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿,使菌液和培養(yǎng)基混勻,待其凝固后培養(yǎng)。 ( 1)平板劃線分離法:被普遍采用 ,在已凝固的平板培養(yǎng)基表面劃線 如果菌液濃度大,培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng)角度減小,增加劃線的次數(shù) 劃 4條線后,將接種環(huán)滅菌,培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng) 90176。 ( 5) 種子帶菌的分離 選擇病種子 , 以 % 升汞液表面消毒 1-2min, 滅菌水洗滌 , 再將此種子在 70% 酒精中浸幾分鐘 , 洗滌 2- 3次 , 取出放在研缽中磨碎 ,離心取上清液 。 由于細(xì)菌位于表皮細(xì)胞和木質(zhì)部之間 , 因此應(yīng)用酒精棉花擦拭表面 , 在火焰上表面消毒 ,再在滅菌皿中實(shí)行解剖后以滅菌玻棒將其搗碎 ,靜置浸泡 24h。 如果莖部較粗 , 也可以在表面消毒后用解剖刀橫斷莖部 , 用夾子或手緊壓莖部橫斷面 , 擠出溢膿或汁液 。 ( 二 ) 植物病原細(xì)菌的分離 1. 細(xì)菌懸浮液的配制 ( 不同癥狀類型分離材料的選擇和表面消毒 ) :將切取的組織塊在 70% 乙醇中浸一下立即取出 , 然后用表面消毒劑進(jìn)行表面消毒 , 可以采用 % 升汞 , 15″- 2min或 %的次亞氯酸鹽如漂白粉 ( 1: 9稀釋液 ) 2min 3次 , 將病組織放在另一個(gè)培養(yǎng)皿的滅菌水中 , 剪破中心或以滅菌玻璃棒研碎病組織靜置 20- 30分鐘 , 等細(xì)菌游出 。 加上滅菌蓋玻片 , 靜置約 10min左右 , 觀察是否有云霧狀自
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