植物病原細(xì)菌學(xué)實(shí)驗(yàn)-文庫(kù)吧資料
2025-01-12 05:28本頁(yè)面
【正文】 管取出后 ， 放在4℃ 冰箱中 ， 看其是否凝固 ， 如不凝固 ， 則說明明膠分解而導(dǎo)致液化 ， 為陽(yáng)性反應(yīng) 。 1） 接菌：采用穿刺法接菌后 ， 放在適溫中培養(yǎng) 13周 。 2） 接菌：將細(xì)菌接種于試管中的培養(yǎng)液中后 ， 用上述制備的濾紙條夾在棉花塞和試管壁之間 ， 使紙條懸在培養(yǎng)液面上 ， 但不要碰到培養(yǎng)液 ， 適溫培養(yǎng) 1周 。 3） 結(jié)果觀察：紙條變黑表示有硫化氫產(chǎn)生 ， 為陽(yáng)性反應(yīng) 。 1） 接菌：在培養(yǎng)液中接菌后培養(yǎng) 1周 （二）氮素化合物的分解 2） GriessLlosvary試劑測(cè)定法 試劑 A ： 對(duì) 氨 基 苯 磺 酸 ， 5mol/L 醋酸（ ） 1000ml 試劑 B：二甲基 α 萘胺 6ml， 5mol/L醋酸 1000ml 1） 醋酸鉛濾紙條的制備：將濾紙剪成 5mm 50mm的小條浸在 5%醋酸鉛溶液中 ， 空氣中干燥后 ， 在 120℃烘箱中滅菌 1h。 在 4h內(nèi)出現(xiàn)紅色者為陽(yáng)性反應(yīng) 。 2） 甲基紅試劑配制：甲基紅 300ml的 95%酒精中 ， 然后用蒸餾水稀釋至 500ml。 （ 2 ） 配 制 過 程 ： 將 NH4H2PO4 、 氯化鉀 、 ， 調(diào)節(jié) 加入溴百里酚蘭 ， 最后加入碳素化合物 （ 也可分別滅菌后加入 ） 3） MR試驗(yàn)結(jié)果觀察：取上述培養(yǎng)液 5ml， 加甲基紅試劑 2~3滴 ， 呈明顯紅色為陽(yáng)性 ， 呈黃色為陰性 。 有的細(xì)菌不產(chǎn)酸和氣 ， 有的只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣 ， 少數(shù)植物病原細(xì)菌既產(chǎn)酸又產(chǎn)氣 （ 3） 分裝：將上述培養(yǎng)基分裝于試管中 ， 每管 10 mL左右 。 1%碳素化合物 。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法 （一）碳素化合物的利用 1） 接菌培養(yǎng)：一般每 5 mL培養(yǎng)液接種 108 CFU/ml菌懸液 ， 適溫下培養(yǎng) 34周 。 鑒定中有何作用 ？ 為什么 ？ ， 在操作過程中也要注意動(dòng)作的輕柔 ， 為什么 ？ 3 觀察和記錄 NA平板上的細(xì)菌菌落性狀 、 菌體形狀 、 運(yùn)動(dòng)性和革蘭氏染色結(jié)果 。 （ 4） 媒染劑過濾后 ， 直接將濾液滴在涂片上 ， 處理 57分鐘 （ 5） 用水輕輕洗去染媒劑 ， 甩去載玻片上剩余的水 ，在空氣中干燥后 ， 再加苯酚品紅染劑染色 5分鐘 。 用吸管沿試管壁緩緩加入無菌水 5mL， 靜置 30分鐘左右 ， 配成菌懸液 。 溶液 Ⅱ ： 苯酚 （ 結(jié)晶 ） 5g， 蒸餾水 95mL （ 2） 染液： 2. 染色步驟 （ 1） 載玻片準(zhǔn)備：選用新的或沒有傷痕的 ， 先用洗潔精浸泡洗滌 ， 用清水洗凈后 ， 再放入酸酒精 （ 硫酸與酒精等量混合 ） 中浸泡 2448h， 取出后用清水洗凈 ，再用蒸餾水洗 ， 瀝干水后 ， 浸泡在 95%酒精中備用 。 使用前用蒸餾水稀釋 2倍 ， 染色時(shí)過濾 ， 濾液直接滴在涂片上 。 2. 氫氧化鉀溶解試驗(yàn) （ 1） 試劑： 3％ 氫氧化鉀 （ 2） 方法：取 1－ 2滴 3％ 氫氧化鉀溶液置于干凈的 玻片上 ， 用牙簽取新鮮細(xì)菌培養(yǎng)物與氫氧化鉀混合 ，充分?jǐn)嚢?10－ 20秒 ， 如果液滴變粘稠并可拉出絲狀物體 ， 表示測(cè)試菌為革蘭氏陰性菌 ， 反之則為革蘭氏陽(yáng)性菌 。 E. 用 95%酒精褪色約 30秒 。 C. 結(jié)晶紫染色 1分鐘 ， 水洗數(shù)秒鐘 ， 吸干 。 將 碘和碘化鉀在研缽中研和 ， 慢慢加水并繼續(xù)研和直至碘和碘化鉀溶解 ， 然后加水稀釋到 300mL， 盛入棕色試劑瓶 ， 放暗處備用 。 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和操作方法 （一）革蘭氏染色 （ 1） 試劑 A. 結(jié)晶紫草酸銨染劑： 溶液 Ⅰ ： 結(jié)晶紫 ， 酒精 （ 95%） 20mL 混合溶液 Ⅰ 和 Ⅱ ， 過濾 ， 貯藏于試劑瓶中 ， 24h后使用 。 5. 結(jié)果觀察：在 24～ 48h表現(xiàn)枯斑為陽(yáng)性反應(yīng) ，3d左右出現(xiàn)黃斑為陰性反應(yīng) 。 用滅菌水作陰性對(duì)照 ， 同屬HR陽(yáng)性的菌株作陽(yáng)性對(duì)照 。 1. 配制 107108CFU/mL的細(xì)菌懸浮液 ， 菌齡 48小時(shí)左右； （二）致病性測(cè)定 2. 指示植物的選擇：一般用煙草 ， 在假單胞和黃單胞菌屬上較適用 。 將冷卻至 45℃ 左右的培養(yǎng)基倒入裝有稀釋菌液的培養(yǎng)皿中，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)皿，使菌液和培養(yǎng)基混勻，待其凝固后培養(yǎng)。 （ 1）平板劃線分離法：被普遍采用 ，在已凝固的平板培養(yǎng)基表面劃線 如果菌液濃度大，培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng)角度減小，增加劃線的次數(shù) 劃 4條線后，將接種環(huán)滅菌，培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)動(dòng) 90176。 （ 5） 種子帶菌的分離 選擇病種子 ， 以 ％ 升汞液表面消毒 1－2min， 滅菌水洗滌 ， 再將此種子在 70％ 酒精中浸幾分鐘 ， 洗滌 2－ 3次 ， 取出放在研缽中磨碎 ，離心取上清液 。 由于細(xì)菌位于表皮細(xì)胞和木質(zhì)部之間 ， 因此應(yīng)用酒精棉花擦拭表面 ， 在火焰上表面消毒 ，再在滅菌皿中實(shí)行解剖后以滅菌玻棒將其搗碎 ，靜置浸泡 24h。 如果莖部較粗 ， 也可以在表面消毒后用解剖刀橫斷莖部 ， 用夾子或手緊壓莖部橫斷面 ， 擠出溢膿或汁液 。 （ 二 ） 植物病原細(xì)菌的分離 1. 細(xì)菌懸浮液的配制 （ 不同癥狀類型分離材料的選擇和表面消毒 ） ：將切取的組織塊在 70％ 乙醇中浸一下立即取出 ， 然后用表面消毒劑進(jìn)行表面消毒 ， 可以采用 ％ 升汞 ， 15″－ 2min或 ％的次亞氯酸鹽如漂白粉 （ 1： 9稀釋液 ） 2min 3次 ， 將病組織放在另一個(gè)培養(yǎng)皿的滅菌水中 ， 剪破中心或以滅菌玻璃棒研碎病組織靜置 20－ 30分鐘 ， 等細(xì)菌游出 。 加上滅菌蓋玻片 ， 靜置約 10min左右 ， 觀察是否有云霧狀自
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