【正文】 化合物。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，花生樣品均有不同濃度的 PC4 化合物的發(fā)現(xiàn)，表 是測定結(jié)果， PC4 花生樣品譜圖如圖 所示。表格 反映了回收率與精密度分析的結(jié)果 。當(dāng)濃度為 － ，線性方程為 y = + 80275（ r=） 當(dāng)信噪比 S/N=3 時(shí)，儀器檢出限為 /L，定量限為 /L。從圖 6b 可以得出 ， 信號反應(yīng)最強(qiáng)的是 m/z1018 的 [M ]+母離子峰 ； m /z 698 的是 [MGluCysAla]+離子峰， m/z 929 的為 [MAla]+離子峰，均為斷裂峰 ； m/z1019 為 [M + H ]+離子峰， m /z 521 為[M+H+ Na]2 +離子峰 ， m /z 1056 為 [M H + K ]+離子峰 ， 大概是由于環(huán)境，樣品和容器含鉀， N 和其他堿金屬，由于去除堿金屬樣品存在困難，所以在質(zhì)譜， K 離子 往往 往 作為一個(gè)特征離子。圖 為條件優(yōu)化以后 PC4 的總離子流圖，圖 為 PC4 化合物在正離子模式下的掃描質(zhì)譜圖。 8 圖 花生樣品中 GSH， PCs的分離色譜圖 圖 Cd脅迫下花生中 GSH， PCs的 含量 花生樣品中 PC4 的含量檢測 選擇 HPLC 質(zhì)譜條件 選用正離子模式，負(fù)離子形式分別掃描濃度為 /L 的 PC 標(biāo)準(zhǔn)溶液，證實(shí)PC4 在負(fù)離子模式下信號反應(yīng)很弱，在正離子模式下反應(yīng)信號比較靈敏。 7 第 2 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果和討論 PCs 標(biāo)準(zhǔn)樣品混合物的色譜分離 經(jīng)提取的 GSH， PCs 巰基化 合物和衍生試劑 (mBBr) 在 45℃的條件下衍生反應(yīng)40min 以后，生成帶有熒光的衍物 mBSR， 在 MBSR 流線（ ACN % TFA）下，一定濃度的混合樣品的 4 種化合物和 GSH 的 分離是很清楚的，依次是 GSH ＞ PC2 ＞ PC3 ＞ PC4 這樣的分離順序 。 色譜質(zhì)譜條件 （ 1） 實(shí)驗(yàn)的色譜條件 ： 選用洗脫劑為 0 .1 % 三氟乙酸 ( TFA)乙腈進(jìn)行梯度淋洗， 流速為 /min； 淋洗梯度條件見表 ； 設(shè)置柱溫為 30℃ ； 220280 nm的 二極管陣列檢測 ； 進(jìn)樣容量為 10ml。 衍生試劑 (mBBr)的配制及柱前衍生反應(yīng) 6 衍生試劑必須現(xiàn)配現(xiàn)用，用 100%的乙腈正確配制 250mmol /L的 mBBr衍生試劑，搖勻后，置于 4℃冰箱避光保存。 巰基化合物標(biāo)準(zhǔn)品的配制 選用 % TFA(含 /L 的 LDTPA) 制成 4 種巰基化合物貯備液 ，濃度均為 1mmol /L 的，分別為： Cd PC 標(biāo)準(zhǔn)品（ (美國 Waters 公司）， Cys 和 GSH 備用液，置于 4℃冰箱保存 。 實(shí)方法驗(yàn) 花生樣品的處理 花生種植后，樣品被粉碎，利用索氏提取脫脂，脫脂干燥后是一種粗蛋白粉，稱 0 . g 蛋白粉末。見 圖 圖 PC解除重金屬的毒害作用機(jī)理示意圖 5 第 1 章 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)材料、試劑及儀器 該實(shí)驗(yàn)所用的實(shí)驗(yàn)試劑有：三氟乙酸（分析純，沈陽新紀(jì)化學(xué)公司） ； 乙腈 (色譜純 ，沈陽新紀(jì)化學(xué)公司 )； (γ G l uCys) 4β A la(北京盛科博源生物科技有限公司 )；PC 標(biāo)準(zhǔn)品（純度 97%的丙氨酸類植物螯合肽 PC4 )； 去離子水 ； 花生。當(dāng) Cd2+進(jìn)入到細(xì)胞后， PC 合酶與 Cd2+形成硫含量低的 PcCd 復(fù)合物，它在重金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白hmtl( heavy metal toleranee)（位于液泡膜上）的幫助下進(jìn)入到液泡里面，接著和液泡中的 Cd2+、硫化物結(jié)合形成毒性較低的 HMW，從而解除了 Cd2+的毒性。 Howden 等從被 Cd2+誘導(dǎo)的植物中分離出兩種 PCCd 復(fù)合物，一種是硫含量低的PcCd 復(fù)合物和含硫量高的 pCCdS 復(fù)合物，它們均是可溶性化合物，硫含量低的PcCd 是 Cd2+ 的運(yùn)輸載體，大多數(shù)在細(xì)胞質(zhì)中 ； 硫含量高的 pCCdS 是液飽中 Cd 2+存在的主要方式。許多試驗(yàn)表明，隨著鎘濃度的增加，鎘螯合肽細(xì)胞數(shù)量也增加，高分子螯合肽含量也增加，這些研究表明， PC 可以減輕鎘的毒性作用，越來越多的研究表明， PC 不僅可以緩解重金屬鎘對植物的毒性作用還可以提高對重金屬鎘的抗性。 PC 對重金屬的解毒作用 PC 可提高植物對重金屬的抗性 斯特芬和其他科學(xué)家在 1986 年使番茄品種細(xì)胞用足以致死的濃度處理，獲得了抗 Cd2+的細(xì)胞，獲得的抗性細(xì)胞中，植物螯合肽的累積量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞， 但隨著 γ谷氨酰半胱氨酸合成酶抑制劑 BSO（丁亞磺酰亞胺）作用于 Cd2+抗性細(xì)胞之后，其又恢復(fù)了對 Cd2+的敏感性，所以 他們認(rèn)為 PC 含量與細(xì)胞對 Cd2+的抗性有關(guān)，做了不同植物的實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果是一樣的。 PC 是以谷胱甘肽 (GSH)為底物的酶促反應(yīng) 關(guān)于 GSH 合成 PC 的過程，研究者普遍認(rèn)為按一下方式進(jìn)行的： ATP ATP 圖 PC 的生物合成過程 半胱氨酸： Cys； 谷氨酸： Glu； 甘氨酸： Gly； 谷胱甘肽： GSH 谷胱甘肽酶： GS； γ谷氨酰半胱氨酸 合成酶 ： GCS； 植螯合肽： PC； 植物螯合肽合成酶： PCS 第一步 γGCS 使用 ATP 把 Cys 和 Glu 連接成 γ Glu Cys，再由 ATP 供應(yīng)能量， 谷胱甘肽合成酶（ GS）在 γ谷氨酸 半胱氨酸連接甘氨酸殘基，從而合成一個(gè) γ谷氨酸 半胱氨酸甘氨酸分子即 GSH，植物螯合肽合成酶（植物 chelatin 合成酶， PCS） N端具有有源區(qū)和信號區(qū)，沒有 Cd2 +的存在時(shí)， C 端檢測領(lǐng)域不會(huì)觸發(fā)信號，則 N 端的激活結(jié)構(gòu)域的酶就無活性 ； 而當(dāng)溶液中有 Cd2+時(shí)，信號檢測域感受到 Cd2+，與Cd2+、 Cys 連接構(gòu) 成特別的空間結(jié)構(gòu)，使酶的 N 端區(qū)域擁有催化活性。當(dāng)植物 組織液 、細(xì)胞生長介質(zhì)或酵母培養(yǎng)液中加入微量重金屬元素時(shí) ， 即可誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生少量 PC，其中 Cd2+對 PC 的影響最大。螯合作用是指植物中的重金屬經(jīng)過與 PC 這種高親和力物絡(luò)合成螯合物從而使重金屬離子在植物體內(nèi)的濃度降低 ， 削弱其毒性。 PC 合成 Salt 等研究者將植物對金屬的解毒機(jī)制分為生物轉(zhuǎn)化、細(xì)胞修復(fù)作用、區(qū)室化作用、螯合作用這四個(gè)方面。 PC 的測定方法 PC 的測定方式包含高效液相色譜 氨基酸主動(dòng)分析聯(lián)用法、前衍生反相高效液相色譜熒光檢測法、電化學(xué)法、 電泳法。 PC 螯合重金屬的原理 植物螯合肽對重金屬離子具備很強(qiáng)的螯合能力，因此在重金屬的積聚與解毒過程當(dāng)中起著決定性功能。研究表明 PC 由 Glu、 Cys、 Gly三種氨 基酸組成，分子量位于 之間。 Plant chelating peptide (PC)。 distribution of the linear range was mg/L (R2 = ), and between the recovery rate was over 80%, relatively high sensitivity. Choosing the way of peanut chelating peptide was found quantitative analysis. The results showed that the Peanuts polluted by heavy metal cadmium were detected with different concentration of plant chelating peptide. The purpose of the study was to do a contribution for heavy metal cadmium pollution reduced. Key words ： Cadmium pollution。 本實(shí)驗(yàn)的目的在于為重金屬鎘污染的減弱做一份貢獻(xiàn)。選用該方式對花生中的螯合肽做定量分析，證明了花生中有植物螯合 肽。 本實(shí)驗(yàn) 利用 C 反相柱 ，用 乙腈 和 %的三氟乙酸檢測 了 花生中在不同濃度鎘誘導(dǎo)下形成的植物螯合肽含量。 本研究以花生形成的植物螯合肽 含量為指標(biāo)，探索了不同濃度的鎘誘導(dǎo)花生產(chǎn)生植物螯合肽含量的影響。由于鎘 會(huì) 損 傷腎小管，病 人會(huì) 出現(xiàn)糖尿、蛋白尿和氨基酸尿 的癥狀 。其它臟器 例 如 胰、 脾、 甲狀腺和毛發(fā)等也 會(huì)累積 一定量。研究發(fā)現(xiàn) 鎘被人體吸收后，在體內(nèi) 變成 鎘硫蛋白， 鎘硫蛋白 具有 選擇性 ，可累積 于腎、肝中。 題 目： 花生中植物螯合肽 PC 的研究