【正文】 L2 FADD rabbit polyclonal IgG rabbit polyclonal IgG rabbit polyclonal IgG rabbit polyclonal IgG 1: 300 1:600 1:800 1:1000 secondary antibody goat antirabbit IgGHRP 1: 5000 secondary antibody goat antimouse IgGHRP 1: 10000 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1. Drug A 時(shí)間劑量性的抑制 HepG2 細(xì)胞增殖 我們選擇 MTT 法來考察 培養(yǎng) HepG2 細(xì)胞 24 后， A 對(duì)細(xì)胞的生長抑制作用。 7） 按 ml/cm2加入含第二抗體的無磷酸鹽及無疊氮化鈉的封閉液中，其中以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗稀釋 1,000 倍。 5） 再按 ml/cm2加入含第一抗體的封閉液，室溫過夜，（各種抗體稀釋倍數(shù)如 Tab. 32）。 3） 轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜進(jìn)入麗春紅 S 染液中 510 min，期間輕輕搖動(dòng)，蛋白帶子出現(xiàn)后用去離子水漂洗數(shù)次，用防水墨汁標(biāo)記出標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的位置。將硝酸纖維素膜浸在去離子水中除去氣泡。 4） 積層膠聚合完全后，在電泳儀中加滿 1的電泳緩沖液，將樣品按預(yù)定的順序加到樣品孔中開始電泳，樣品在積層膠時(shí)電壓為 75V, 待樣品泳到分離膠時(shí)將電壓調(diào)至 180V。 分離膠完全聚合后，清除異丙醇用去離子水洗 3 次，用濾紙吸去水，按 Tab. 22B 配制積 2） 層膠，加入到電泳槽后立即插入干凈的樣品梳。 2. 蛋白質(zhì)電泳 1） 按 Tab. 22A 配制 15 ％， 12 %或 10 ％的丙稀酰胺分離膠，依次混合各成分，一旦加入TEMED，馬上開始聚合，立即快速旋轉(zhuǎn)混合物灌制在電泳槽的兩玻璃板之間，留出灌制積層膠所需的空間。 11) 無磷酸鹽，無疊氮化鈉封閉液： 5 ％脫脂奶粉， 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L TrisHCl (pH )。 9） 10 麗春紅染料： 2 g 麗春紅 S， 30 g 三氯乙酸， 30 g 磺基水楊酸加水至 100 ml。 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 7 7） 加樣緩沖液： 50 mmol/L TrisHCl (pH ), 100 mmol/L 二巰基乙醇（ 2ME） , 2 % SDS， ％溴酚藍(lán)， 10 ％ 甘油。即在 900 ml 去離子水中溶解 g Tris 堿和 94 g 甘氨酸，然后加入 50 ml 10 ％（ w/v）的電泳級(jí)的 SDS 儲(chǔ)存液，用去離子水補(bǔ)至 1000 ml 量則成 5儲(chǔ)存液。 5） Tris－ 甘氨酸電泳緩沖液。 4） 過硫酸銨。用 Tris 堿完全溶于去離子水后，用 HCl 調(diào)節(jié)溶液的 pH 值。 2） 用于制備分離膠和積層膠的 Tris 緩沖液。 1. 工作液的配制 1） 丙稀酰胺和 N, N’－ 亞甲基雙丙稀酰胺儲(chǔ)存液。固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成分保留抗原活性及與其它大分子物質(zhì)特異結(jié)合的能力，所以能與特異的抗體或核酸結(jié)合。 五 、 Western blot analysis (免疫印跡法 ) [5,6] Western blot 是一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)。然后用 70%乙醇固定過夜。ΜΜ因此，在流式細(xì)胞術(shù)中常用 PI 測(cè)定細(xì)胞活力。 PI 不能穿過活細(xì)胞膜，故活細(xì)胞拒染；但能穿 過死細(xì)胞膜，使之著色。加入 稀釋 1000倍的 AO于 37℃ 避光染色 1 h，于激發(fā)波長為 380 nm，發(fā)射波長為 525 nm的熒光顯微鏡下拍照。 三、 細(xì)胞熒光染色的觀察 吖啶橙（ AO）能夠?qū)⒌?亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色成可見致密濃染的黃綠色，在 380 nm激發(fā)光下發(fā)出黃綠色亮光。凋亡過程中，磷脂酰絲氨酸外翻；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、邊緣化、 DNA發(fā)生有序裂解，形成 180200 bp的整數(shù)倍片斷 。 取 HepG2 細(xì)胞，密度為 6 103個(gè) /孔，接種于 96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h 后加入不同濃度的 Drug A 和 Drug B 及 Drug A、 Drug B 聯(lián)合用藥培養(yǎng) 24 h 后，加入不同濃度 Drug A 作用6h、 12h、 24h、 36h、 48 h 以 MTT 法測(cè)定細(xì)胞死亡率。可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素 c 的作用下 tetrazoliu 環(huán)開裂，生成藍(lán)紫色的結(jié)晶甲臜 (formazan)，甲臜結(jié)晶的生成量?jī)H與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原）。 三、儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱（ NuAir， Plymouth， MA， USA），酶 聯(lián)免疫分析儀（ Tecan， Salzburg， 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 5 Austria）， 6 孔、 24 孔與 96 孔培養(yǎng)板（ Nunc， Roskilde， Denmark），倒置相差顯微鏡（ Leica， Bensheim， Germany），熒光顯微鏡（ Olympus， Tokyo， Japan），流式細(xì)胞分析儀（ Becton Dickinson FACScan， Franklin lakes， NJ， USA）， DYY2 型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀， DYYIII28A 型蛋白質(zhì)電泳儀， DYYIII40B 電泳槽（北京六一儀器廠）。 1640培養(yǎng)基，美國 Gibco公司（ Grand Island， NY， USA）；胎牛血清，購于北京元亨圣馬生物技術(shù)研究所；胰蛋白酶、谷氨酰胺、青 霉素、鏈霉素、 Hepes、二甲基亞砜（ DMSO）、甲基噻唑藍(lán)（ MTT）、碘化丙啶 (PI)、丹磺酰戊二胺（ monodansyl cadaverine， MDC）、 RNase、Protein K、瓊脂糖、溴酚藍(lán)、二氨基聯(lián)苯胺和 ECL試劑盒購于美國 Sigma公司。接種在 含 10％胎牛血清、 2％谷氨酰胺 的 1640 培養(yǎng)液中，在 37℃， 5％ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。臨床試用表明該藥作用強(qiáng)，療效顯著。對(duì)肝炎患者癥狀、肝功能均有明顯的改善。此外，藥物 B 可以選擇性清除羥自由基 (?OH)，且對(duì) NFκB 有明顯的抑制作用。但在治療的同時(shí)，藥物 A 也會(huì)使患者的轉(zhuǎn)氨酶短暫性升高（ 22％）、酯酶增加等，因此能加重對(duì)肝腎功能的損沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第一章 緒論 4 害。 另一方面它可以通過上游 抑制受體酪氨酸激酶 VEGFR 和 PDGFR, 及下游抑 RAF/MEK/ ERK 途徑中絲氨酸 / 蘇氨酸激酶 , 抑制腫瘤新生血管的形成和切斷腫瘤細(xì)胞的營養(yǎng)供應(yīng)而達(dá)到遏制腫瘤生長的目。 Drug A 屬于多酶抑制劑 , 能抑制 RAF BRAF 絲氨酸 / 蘇氨酸激酶的活性 , 以及血管內(nèi)皮生長因子 ( VEGF VEGF3) 、血小板衍化生長因子 ( PDGF) 、受體酪氨酸激酶 KIT、 FMS 樣酪氨酸激酶 3( FLT3) 等多種受體的酪氨酸激酶活性。因此治療肝癌藥物與保肝藥物合用起到減毒增效的作用對(duì)肝癌患者具有極其重要的臨床意義。 關(guān)鍵詞 聯(lián)合用藥，細(xì)胞凋亡，作用機(jī)制 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 英文摘要 2 Abstract Hepatocellular carcinoma (HCC) is the most mon cancer in the world and an increased malignant illness in our country. Because of its aggressive biological behavior, rapidly progresses and delayed diagnosi