【文章內(nèi)容簡介】 diphenyltetrazolium bromide, MTT]是一種能接受氫原子的染料?？勺饔糜诨罴?xì)胞線粒體中的呼吸鏈，在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素 c 的作用下 tetrazoliu 環(huán)開裂，生成藍(lán)紫色的結(jié)晶甲臜 (formazan)，甲臜結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比（死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失，不能將 MTT 還原）。用 DMSO 溶解甲臜后，在一定波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值，即可定量測出細(xì)胞的存活率。 取 HepG2 細(xì)胞，密度為 6 103個(gè) /孔，接種于 96 孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h 后加入不同濃度的 Drug A 和 Drug B 及 Drug A、 Drug B 聯(lián)合用藥培養(yǎng) 24 h 后，加入不同濃度 Drug A 作用6h、 12h、 24h、 36h、 48 h 以 MTT 法測定細(xì)胞死亡率。按下列公式計(jì)算： 死亡率（ %） = [A492（陰性對照）－ A492（加藥組） ] / A492（陰性對照） 100 二、 細(xì)胞形態(tài)的觀察 細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變是 多階段的，其顯著特征表現(xiàn)為：首先是細(xì)胞膜突起、細(xì)胞體積縮??；接著部分細(xì)胞器、核糖體和核碎片被細(xì)胞膜包裹形成凋亡小體，從細(xì)胞表面出芽脫落；最后被具有吞噬功能的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等吞噬。凋亡過程中，磷脂酰絲氨酸外翻；細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、邊緣化、 DNA發(fā)生有序裂解，形成 180200 bp的整數(shù)倍片斷 。 取對數(shù)生長期的 HepG2細(xì)胞，密度為 6 103個(gè) /孔，接種于 96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng) 24 h后，加入不同濃度 Drug A作用 24h，在 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。 三、 細(xì)胞熒光染色的觀察 吖啶橙（ AO）能夠?qū)⒌?亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色成可見致密濃染的黃綠色，在 380 nm激發(fā)光下發(fā)出黃綠色亮光。 以每孔 2104個(gè)細(xì)胞的密度接種于 24 孔板中， 培養(yǎng) 24h后，加入不同濃度的 Drug A與不同濃度的 Drug B作用 24h后， 去培養(yǎng)液，用 PBS洗一次。加入 稀釋 1000倍的 AO于 37℃ 避光染色 1 h，于激發(fā)波長為 380 nm，發(fā)射波長為 525 nm的熒光顯微鏡下拍照。 四、 流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 6 PI(碘化丙啶 )為核酸嵌入型染料，可嵌入雙股螺旋多核苷酸結(jié)構(gòu)，故 DNA 和 RNA 均可著色。 PI 不能穿過活細(xì)胞膜，故活細(xì)胞拒染；但能穿 過死細(xì)胞膜，使之著色。 PI 鑒別細(xì)胞死活的靈敏度很高。因此，在流式細(xì)胞術(shù)中常用 PI 測定細(xì)胞活力。 以每瓶 2105個(gè)細(xì)胞的密度接種于 6 孔板中 ，培養(yǎng) 24 h 后 分別加入 6181。ΜL1的 Drug A， 100181。ΜL1的 Drug B，及兩藥聯(lián)合作用組，作用 24 h 后，收集細(xì)胞，用 PBS 清洗一次。然后用 70%乙醇固定過夜。次日將單細(xì)胞懸液離心棄去固定液，用 PBS 洗滌 12 次，加入 50 mg/L(% RNase)， PBS 配 PI 染色液 mL，置 4?C 避光染色 1 h 后用流式細(xì)胞儀分析，測定細(xì)胞凋亡情況。 五 、 Western blot analysis (免疫印跡法 ) [5,6] Western blot 是一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)。將已用聚丙烯酰胺凝膠或其他凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成分保留抗原活性及與其它大分子物質(zhì)特異結(jié)合的能力，所以能與特異的抗體或核酸結(jié)合。第一抗體與特異性抗原決定簇結(jié)合，再用經(jīng)標(biāo)記（同位素或非同位素）的第二抗體來測檢。 1. 工作液的配制 1） 丙稀酰胺和 N, N’－ 亞甲基雙丙稀酰胺儲(chǔ)存液。使用去離子水配制含有 29 ％（ W/V）丙稀酰胺和 1 ％（ W/V） N, N’－亞甲基雙丙稀酰胺儲(chǔ)存液。 2） 用于制備分離膠和積層膠的 Tris 緩沖液。制備這些緩沖液必須使用 Tris 堿。用 Tris 堿完全溶于去離子水后，用 HCl 調(diào)節(jié)溶液的 pH 值。 分離膠緩沖液： mol/L TrisHCl (pH ) 積層膠緩沖液： mol/L TrisHCl (pH ) 3） 十二烷基磺酸鈉（ SDS）：用去離子水配成 10 ％的儲(chǔ)存液室溫備用。 4） 過硫酸銨。用去離子水配制少量的 10 ％（ w/v）的儲(chǔ)備液保存于 4℃，由于過硫酸銨會(huì)緩慢分解，故應(yīng)隔周新鮮配制。 5） Tris－ 甘氨酸電泳緩沖液。 25 mmol/L Tris 堿， 250 mmol/L 甘氨酸（電泳級）， ％ SDS, 可配成 5儲(chǔ)存液備用。即在 900 ml 去離子水中溶解 g Tris 堿和 94 g 甘氨酸，然后加入 50 ml 10 ％（ w/v）的電泳級的 SDS 儲(chǔ)存液，用去離子水補(bǔ)至 1000 ml 量則成 5儲(chǔ)存液。 6） 細(xì)胞裂解液： 50 mmol/L Hepes (pH ), 1 % TritonX 100, 100 mmol/L NaF, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 2 mmol/L 正釩酸鈉， 1 mmol/L PMSF, 使用前加入： 10 μg/ml (aprotinin, leupeptin, pepstatin A)。 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 7 7） 加樣緩沖液： 50 mmol/L TrisHCl (pH ), 100 mmol/L 二巰基乙醇（ 2ME） , 2 % SDS， ％溴酚藍(lán)， 10 ％ 甘油。 8） 轉(zhuǎn)移緩沖液： g Tris 堿， g 甘氨酸加入 240 ml 甲醇，用去離子水補(bǔ)至 1200 ml。 9） 10 麗春紅染料： 2 g 麗春紅 S， 30 g 三氯乙酸， 30 g 磺基水楊酸加水至 100 ml。 10) 封閉液： 5 ％脫脂奶粉， ％ Tween20, % 疊氮化鈉溶于 PBS 溶液中。 11) 無磷酸鹽，無疊氮化鈉封閉液： 5 ％脫脂奶粉， 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L TrisHCl (pH )。 12) 二氨基聯(lián)苯胺溶液： 9 ml mol/L TrisHCl (pH ) 溶液中溶解 6 mg 二氨基聯(lián)苯胺，向其中加入 1 ml % CoCl2。 2. 蛋白質(zhì)電泳 1） 按 Tab. 22A 配制 15 ％， 12 %或 10 ％的丙稀酰胺分離膠，依次混合各成分，一旦加入TEMED，馬上開始聚合，立即快速旋轉(zhuǎn)混合物灌制在電泳槽的兩玻璃板之間，留出灌制積層膠所需的空間。在分離膠上覆蓋一層異丙醇，將凝膠垂直放置在室溫約 30 min。 分離膠完全聚合后，清除異丙醇用去離子水洗 3 次，用濾紙吸去水，按 Tab. 22B 配制積 2） 層膠，加入到電泳槽后立即插入干凈的樣品梳。 3） 在積層膠聚合時(shí)可把收集的 Drug A 和 Drug B 聯(lián)合用藥處理 過的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液在冰浴上裂解 60 min， 7,000 g 離心 10 min, 取上清加入 2的上樣緩 沖液，在沸水浴中加熱 5 min 使蛋白質(zhì)變性，采用 BioRad 蛋白濃度測定液測定樣品中蛋白濃度，并調(diào)整各樣品的濃度相同。 4） 積層膠聚合完全后，在電泳儀中加滿 1的電泳緩沖液，將樣品按預(yù)定的順序加到樣品孔中開始電泳，樣品在積層膠時(shí)電壓為 75V, 待樣品泳到分離膠時(shí)將電壓調(diào)至 180V。 1） SDS 聚丙稀胺凝膠電泳結(jié)束后，將膠放置到轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡 30 min, 切 6 張 Whatman 3 MM 濾紙和 1 張硝酸纖維素膜，與凝膠大小相符合。將硝酸纖維素膜浸在去離子水中除去氣泡。 2） 將凝膠按疊成“三明治”狀，插 入轉(zhuǎn)移池中，凝膠一面接陰極， 15V 轉(zhuǎn)移過夜。 3） 轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜進(jìn)入麗春紅 S 染液中 510 min，期間輕輕搖動(dòng)，蛋白帶子出現(xiàn)后用去離子水漂洗數(shù)次，用防水墨汁標(biāo)記出標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的位置。 4） 將膜放入小盒中，按 ml/cm2加入封閉液，封閉 4 h。 5） 再按 ml/cm2加入含第一抗體的封閉液，室溫過夜，（各種抗體稀釋倍數(shù)如 Tab. 32）。 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 8 6） 回收一抗，用 PBS 漂洗膜 3 次，每次 10 min，將膜轉(zhuǎn)移到含 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L TrisHCl (pH ) 的溶液 中搖動(dòng) 10 min。 7） 按 ml/cm2加入含第二抗體的無磷酸鹽及無疊氮化鈉的封閉液中，其中以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗稀釋 1,000 倍。 8） 以用 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L TrisHCl (pH ) 溶液漂洗 3 次，每次 10 min，再將膜放入 10 ml 二氨基聯(lián)苯胺溶液中（含 10 μl 30％的 H2O2），約 5 min 后可觀察到蛋白帶子的出現(xiàn)，待其顏色達(dá)到要求，用常水略漂洗，掃描圖片保存。 Table 22A 配制電泳分離膠所用溶液 溶液成分 15 ml 凝膠 30 ml 凝膠 10％ 蒸餾水 30 ％ 丙稀酰胺溶液 mmol/L Tris (pH ) 10 % SDS 10 % 過硫酸銨 TEMED 12 % 蒸餾水 30 ％ 丙稀酰胺溶液 mmol/L Tris (pH ) 10 % SDS 10 % 過硫酸銨 TEMED 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文