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正文內(nèi)容

藥學(xué)本科畢業(yè)論文-化合物a聯(lián)合化合物b對人肝癌hepg2細(xì)胞作用機(jī)制研究(編輯修改稿)

2025-07-10 13:54 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 diphenyltetrazolium bromide, MTT]是一種能接受氫原子的染料。可作用于活細(xì)胞線粒體中的呼吸鏈,在琥珀酸脫氫酶和細(xì)胞色素 c 的作用下 tetrazoliu 環(huán)開裂,生成藍(lán)紫色的結(jié)晶甲臜 (formazan),甲臜結(jié)晶的生成量僅與活細(xì)胞數(shù)目成正比(死細(xì)胞中琥珀酸脫氫酶消失,不能將 MTT 還原)。用 DMSO 溶解甲臜后,在一定波長下用酶標(biāo)儀測定光密度值,即可定量測出細(xì)胞的存活率。 取 HepG2 細(xì)胞,密度為 6 103個(gè) /孔,接種于 96 孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng) 24 h 后加入不同濃度的 Drug A 和 Drug B 及 Drug A、 Drug B 聯(lián)合用藥培養(yǎng) 24 h 后,加入不同濃度 Drug A 作用6h、 12h、 24h、 36h、 48 h 以 MTT 法測定細(xì)胞死亡率。按下列公式計(jì)算: 死亡率( %) = [A492(陰性對照)- A492(加藥組) ] / A492(陰性對照) 100 二、 細(xì)胞形態(tài)的觀察 細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變是 多階段的,其顯著特征表現(xiàn)為:首先是細(xì)胞膜突起、細(xì)胞體積縮??;接著部分細(xì)胞器、核糖體和核碎片被細(xì)胞膜包裹形成凋亡小體,從細(xì)胞表面出芽脫落;最后被具有吞噬功能的細(xì)胞如巨噬細(xì)胞、上皮細(xì)胞等吞噬。凋亡過程中,磷脂酰絲氨酸外翻;細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)濃縮、邊緣化、 DNA發(fā)生有序裂解,形成 180200 bp的整數(shù)倍片斷 。 取對數(shù)生長期的 HepG2細(xì)胞,密度為 6 103個(gè) /孔,接種于 96孔培養(yǎng)板中,培養(yǎng) 24 h后,加入不同濃度 Drug A作用 24h,在 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。 三、 細(xì)胞熒光染色的觀察 吖啶橙( AO)能夠?qū)⒌?亡細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染色成可見致密濃染的黃綠色,在 380 nm激發(fā)光下發(fā)出黃綠色亮光。 以每孔 2104個(gè)細(xì)胞的密度接種于 24 孔板中, 培養(yǎng) 24h后,加入不同濃度的 Drug A與不同濃度的 Drug B作用 24h后, 去培養(yǎng)液,用 PBS洗一次。加入 稀釋 1000倍的 AO于 37℃ 避光染色 1 h,于激發(fā)波長為 380 nm,發(fā)射波長為 525 nm的熒光顯微鏡下拍照。 四、 流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 6 PI(碘化丙啶 )為核酸嵌入型染料,可嵌入雙股螺旋多核苷酸結(jié)構(gòu),故 DNA 和 RNA 均可著色。 PI 不能穿過活細(xì)胞膜,故活細(xì)胞拒染;但能穿 過死細(xì)胞膜,使之著色。 PI 鑒別細(xì)胞死活的靈敏度很高。因此,在流式細(xì)胞術(shù)中常用 PI 測定細(xì)胞活力。 以每瓶 2105個(gè)細(xì)胞的密度接種于 6 孔板中 ,培養(yǎng) 24 h 后 分別加入 6181。ΜL1的 Drug A, 100181。ΜL1的 Drug B,及兩藥聯(lián)合作用組,作用 24 h 后,收集細(xì)胞,用 PBS 清洗一次。然后用 70%乙醇固定過夜。次日將單細(xì)胞懸液離心棄去固定液,用 PBS 洗滌 12 次,加入 50 mg/L(% RNase), PBS 配 PI 染色液 mL,置 4?C 避光染色 1 h 后用流式細(xì)胞儀分析,測定細(xì)胞凋亡情況。 五 、 Western blot analysis (免疫印跡法 ) [5,6] Western blot 是一種蛋白質(zhì)的固定和分析技術(shù)。將已用聚丙烯酰胺凝膠或其他凝膠電泳分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上。固定在濾膜上的蛋白質(zhì)成分保留抗原活性及與其它大分子物質(zhì)特異結(jié)合的能力,所以能與特異的抗體或核酸結(jié)合。第一抗體與特異性抗原決定簇結(jié)合,再用經(jīng)標(biāo)記(同位素或非同位素)的第二抗體來測檢。 1. 工作液的配制 1) 丙稀酰胺和 N, N’- 亞甲基雙丙稀酰胺儲(chǔ)存液。使用去離子水配制含有 29 %( W/V)丙稀酰胺和 1 %( W/V) N, N’-亞甲基雙丙稀酰胺儲(chǔ)存液。 2) 用于制備分離膠和積層膠的 Tris 緩沖液。制備這些緩沖液必須使用 Tris 堿。用 Tris 堿完全溶于去離子水后,用 HCl 調(diào)節(jié)溶液的 pH 值。 分離膠緩沖液: mol/L TrisHCl (pH ) 積層膠緩沖液: mol/L TrisHCl (pH ) 3) 十二烷基磺酸鈉( SDS):用去離子水配成 10 %的儲(chǔ)存液室溫備用。 4) 過硫酸銨。用去離子水配制少量的 10 %( w/v)的儲(chǔ)備液保存于 4℃,由于過硫酸銨會(huì)緩慢分解,故應(yīng)隔周新鮮配制。 5) Tris- 甘氨酸電泳緩沖液。 25 mmol/L Tris 堿, 250 mmol/L 甘氨酸(電泳級(jí)), % SDS, 可配成 5儲(chǔ)存液備用。即在 900 ml 去離子水中溶解 g Tris 堿和 94 g 甘氨酸,然后加入 50 ml 10 %( w/v)的電泳級(jí)的 SDS 儲(chǔ)存液,用去離子水補(bǔ)至 1000 ml 量則成 5儲(chǔ)存液。 6) 細(xì)胞裂解液: 50 mmol/L Hepes (pH ), 1 % TritonX 100, 100 mmol/L NaF, 1 mmol/L EDTA, 1 mmol/L EGTA, 2 mmol/L 正釩酸鈉, 1 mmol/L PMSF, 使用前加入: 10 μg/ml (aprotinin, leupeptin, pepstatin A)。 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 7 7) 加樣緩沖液: 50 mmol/L TrisHCl (pH ), 100 mmol/L 二巰基乙醇( 2ME) , 2 % SDS, %溴酚藍(lán), 10 % 甘油。 8) 轉(zhuǎn)移緩沖液: g Tris 堿, g 甘氨酸加入 240 ml 甲醇,用去離子水補(bǔ)至 1200 ml。 9) 10 麗春紅染料: 2 g 麗春紅 S, 30 g 三氯乙酸, 30 g 磺基水楊酸加水至 100 ml。 10) 封閉液: 5 %脫脂奶粉, % Tween20, % 疊氮化鈉溶于 PBS 溶液中。 11) 無磷酸鹽,無疊氮化鈉封閉液: 5 %脫脂奶粉, 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L TrisHCl (pH )。 12) 二氨基聯(lián)苯胺溶液: 9 ml mol/L TrisHCl (pH ) 溶液中溶解 6 mg 二氨基聯(lián)苯胺,向其中加入 1 ml % CoCl2。 2. 蛋白質(zhì)電泳 1) 按 Tab. 22A 配制 15 %, 12 %或 10 %的丙稀酰胺分離膠,依次混合各成分,一旦加入TEMED,馬上開始聚合,立即快速旋轉(zhuǎn)混合物灌制在電泳槽的兩玻璃板之間,留出灌制積層膠所需的空間。在分離膠上覆蓋一層異丙醇,將凝膠垂直放置在室溫約 30 min。 分離膠完全聚合后,清除異丙醇用去離子水洗 3 次,用濾紙吸去水,按 Tab. 22B 配制積 2) 層膠,加入到電泳槽后立即插入干凈的樣品梳。 3) 在積層膠聚合時(shí)可把收集的 Drug A 和 Drug B 聯(lián)合用藥處理 過的細(xì)胞用細(xì)胞裂解液在冰浴上裂解 60 min, 7,000 g 離心 10 min, 取上清加入 2的上樣緩 沖液,在沸水浴中加熱 5 min 使蛋白質(zhì)變性,采用 BioRad 蛋白濃度測定液測定樣品中蛋白濃度,并調(diào)整各樣品的濃度相同。 4) 積層膠聚合完全后,在電泳儀中加滿 1的電泳緩沖液,將樣品按預(yù)定的順序加到樣品孔中開始電泳,樣品在積層膠時(shí)電壓為 75V, 待樣品泳到分離膠時(shí)將電壓調(diào)至 180V。 1) SDS 聚丙稀胺凝膠電泳結(jié)束后,將膠放置到轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡 30 min, 切 6 張 Whatman 3 MM 濾紙和 1 張硝酸纖維素膜,與凝膠大小相符合。將硝酸纖維素膜浸在去離子水中除去氣泡。 2) 將凝膠按疊成“三明治”狀,插 入轉(zhuǎn)移池中,凝膠一面接陰極, 15V 轉(zhuǎn)移過夜。 3) 轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜進(jìn)入麗春紅 S 染液中 510 min,期間輕輕搖動(dòng),蛋白帶子出現(xiàn)后用去離子水漂洗數(shù)次,用防水墨汁標(biāo)記出標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的位置。 4) 將膜放入小盒中,按 ml/cm2加入封閉液,封閉 4 h。 5) 再按 ml/cm2加入含第一抗體的封閉液,室溫過夜,(各種抗體稀釋倍數(shù)如 Tab. 32)。 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 8 6) 回收一抗,用 PBS 漂洗膜 3 次,每次 10 min,將膜轉(zhuǎn)移到含 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L TrisHCl (pH ) 的溶液 中搖動(dòng) 10 min。 7) 按 ml/cm2加入含第二抗體的無磷酸鹽及無疊氮化鈉的封閉液中,其中以辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗稀釋 1,000 倍。 8) 以用 150 mmol/L NaCl, 50 mmol/L TrisHCl (pH ) 溶液漂洗 3 次,每次 10 min,再將膜放入 10 ml 二氨基聯(lián)苯胺溶液中(含 10 μl 30%的 H2O2),約 5 min 后可觀察到蛋白帶子的出現(xiàn),待其顏色達(dá)到要求,用常水略漂洗,掃描圖片保存。 Table 22A 配制電泳分離膠所用溶液 溶液成分 15 ml 凝膠 30 ml 凝膠 10% 蒸餾水 30 % 丙稀酰胺溶液 mmol/L Tris (pH ) 10 % SDS 10 % 過硫酸銨 TEMED 12 % 蒸餾水 30 % 丙稀酰胺溶液 mmol/L Tris (pH ) 10 % SDS 10 % 過硫酸銨 TEMED 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文
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