【正文】 lich 所言 ” 在分子生物學(xué)的領(lǐng)域中，只要擁有它，你便可以無照營業(yè) ”。 等式僅在限定的擴(kuò)增周期數(shù)（通常為 20 或 30）內(nèi)成立。(1+E)2=…=X 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 共 17 頁 第 8 頁 PCR 擴(kuò)增的理論模式 PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增，每一擴(kuò)增周期后產(chǎn)物的量可以下式表達(dá)： Yn=Yn1平臺期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。其中：C 為擴(kuò)增產(chǎn)物量 , Co 為起始 DNA 量 , P 為增效率 , n 為循環(huán)次數(shù)。通常經(jīng) 2530 輪循環(huán)擴(kuò)增后 , 反應(yīng)中 Taq DNA 聚合酶已經(jīng)不足 , 如果此時(shí)產(chǎn)物量仍不夠 , 需要進(jìn)一步擴(kuò)增 ,可將擴(kuò)增的DNA 樣品稀釋 103105 倍作為模板 , 重新加入各種反應(yīng)底物進(jìn)行擴(kuò)增 , 這樣經(jīng) 60 輪循環(huán)后 , 擴(kuò)增水平可達(dá) 1091010。一般而言 2530 輪循環(huán)已經(jīng)足夠。一般在擴(kuò)增反應(yīng)完成后 ,都需要一步較長時(shí)間 (1030min)的延伸反應(yīng) ,以獲得盡可能完整的產(chǎn)物 , 這對以后進(jìn)行克隆或測序反應(yīng)尤為重要。 3. 延伸：延伸反應(yīng)通常為 72℃, 接近于 Taq DNA 聚合酶的最適反應(yīng)溫度 75℃.實(shí)際上 ,引物延伸在退火時(shí)即已開始 ,因?yàn)?Taq DNA 聚合酶的作用溫度范圍可從 20℃ 85℃. 延伸反應(yīng)時(shí)間的長短取決于目的序列的長度和濃度 .在一般反應(yīng)體系中 ,Taq DNA聚合酶每分鐘約可合成 1kb 長的DNA。有些反應(yīng)甚至可將退火與延伸兩步合并 ,只用兩種溫度 (例如用 60℃ 和 94℃) 完成整個(gè)擴(kuò)增循環(huán) , 既省時(shí)間又提高了特異性。這使得在較為嚴(yán)緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。如果兩個(gè)引物 Tm 不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的 Tm 低5℃ 。退火溫度一般設(shè)定比引物的 Tm 低5℃, 當(dāng)產(chǎn)物中包含有影響實(shí)驗(yàn)的非可異性擴(kuò)增帶時(shí) ,以 2℃ 為增量，逐步提高退火溫度。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證引物同目的序列 有效退火，同時(shí)還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。對于富含 GC 的序列 ,可適當(dāng)提高變性溫度 .但變性溫度過高或時(shí)間過長都會(huì)導(dǎo)致酶活性的損失。變性不完全 ,往往使 PCR 失敗 ,因?yàn)槲醋冃酝耆?DNA 雙鏈會(huì)很快復(fù)性 ,減少 DNA 產(chǎn)量 .一般變性溫度與時(shí)間為 94℃ 1min 。 ⑦ 引物的 5 ′端可以修飾。 ⑤ 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的 同源性不要超過 70%，引物 3′末端連續(xù) 8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。 ③ 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。 ② 引物堿基： G+C 含量以 4060%為宜， G+C 太少擴(kuò)增效果不佳， G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條 DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)）， 5′端引物與位于待擴(kuò)增片段 5′端上的一小段DNA 序列相同； 3′端引物與位于待擴(kuò)增片段 3′端的一小段 DNA 序列互補(bǔ)。利用 PCR 技術(shù)可在數(shù)小時(shí)之內(nèi)大量擴(kuò)增目的基因或 DNA 片段，從而免除基因重組和分子克隆等一系列繁瑣操作。凝膠電泳不僅可以分離不同相對分子質(zhì)量的 DNA， 也 可以分離相對分子質(zhì)量相同，但構(gòu)型不同的 DNA 分子。具有不同的相對分子質(zhì)量的 DNA 片段泳動(dòng)速度不一樣，可進(jìn)行分離。由于糖－磷酸骨架在結(jié)構(gòu)上的重復(fù)性質(zhì)，相同數(shù)量的雙鏈 DNA 幾乎具有等量的凈電荷，因此他們能以相同的速度向正極方向移動(dòng)。 瓊脂糖凝膠電泳原理 DNA 分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。高濃度的 NaCl 可使蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)沉淀。 EDTA 也具有降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性，并抑制 DNase 活性的作用。 SDS 是一種強(qiáng) 陰離子去污劑，其主要作用是： ① 結(jié)合膜蛋白而破壞細(xì)胞膜、核膜； ② 是核蛋白體（ DNP）中的蛋白質(zhì)與 DNA 分離； ③ 與蛋白質(zhì)結(jié)合，使蛋白質(zhì)變性而沉淀。用無 DNA 酶的 RNA 酶水解溶液中的 RNA，最終獲得純度較高的細(xì)菌 DNA。 研究內(nèi)容 （ 1）弗氏檸檬酸桿菌的培養(yǎng) （ 2） 目的基因的構(gòu)建與體外擴(kuò)增 （ 3）表達(dá)產(chǎn)物的鑒別 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 共 17 頁 第 5 頁 2 實(shí)驗(yàn) 原理 SDS 法制備基因組 DNA 的原理 細(xì)菌基因組 DNA （染色體 DNA）的提取一般是先用溶菌酶處理，破壞 細(xì)菌細(xì)胞壁，然后再加入 SDS 和 /或蛋白酶 K，使細(xì)菌細(xì)胞裂解，同時(shí)解離與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，再利用有機(jī)溶劑使蛋白質(zhì)徹底變性。 因此 TPL 是一種廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥行業(yè)的酶類，解決它的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)是一個(gè)迫在眉睫的問題。 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 共 17 頁 第 4 頁 本課題的立題依據(jù)和研究內(nèi)容 立題依據(jù) 酪氨酸酚裂解酶（ Tyrosine Phenollyase， TPL， EC ） 也稱 β酪氨酸酶，在生物體內(nèi)催化 L酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物體外可將苯酚、丙酮酸和氨轉(zhuǎn)化為 L酪氨酸，而 L酪氨酸常作為營養(yǎng)補(bǔ)充劑、苯丙酮尿癥患者的必需氨基酸， 是 L多巴 的重要 制備原料。其主要步驟是：待擴(kuò)增 DNA 于高溫下解鏈成為單鏈模板；人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合； DNA 聚合酶在 72℃將單核苷酸從引物 3’端開始摻入，沿模板 5’→3’ 方向延伸，合成 DNA 新股。 PCR 技術(shù)已成為方法學(xué)上的一次革命，它必將大大推動(dòng)分子生物學(xué)各學(xué)科和研究進(jìn)展。 PCR 技術(shù)能夠快速特異地?cái)U(kuò)增任何目的基因或 DNA 片段，并很容易使得微微克（ pg）水平的起始物達(dá)到毫微克（ ng）水平的量。 隨著生命科學(xué)和經(jīng) 濟(jì)的不斷發(fā)展，人們對醫(yī)藥水平的要求在不斷的提高。它具有強(qiáng)大的擴(kuò)增能力，并且可與其他分子生物學(xué)方法和免疫學(xué)方法相結(jié)合應(yīng)用，使其敏感性和特異性都大大增強(qiáng)。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，一些學(xué)者開始運(yùn)用基因工程的手段從含有 TPL 基因的野生菌株染色體 DNA 中克隆得到 TPL 基因片段，將其連接到不同的載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)。 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 共 17 頁 第 3 頁 酪氨酸酚裂解酶，又名 β酪氨酸酶，以磷酸吡哆醛為輔酶， TPL 可以催化L酪氨酸發(fā)生 β消去反應(yīng)生成苯酚、丙酮酸和氨。隨后， John 等在蠟狀芽孢桿菌（ Bucillus cereus）中也發(fā)現(xiàn)酪氨酸酶，并用來生產(chǎn) LDOPA。 生物合成 LDOPA 上世紀(jì) 60 年代，國外許多學(xué)者開始致力于微生物酶法合成 LDOPA 的研究。解決此問題的最好辦法是使 D型和 L型多巴完全分開，但 D型和 L型多巴的拆分非常困難。綜合國內(nèi)外研究狀況，目前， LDOPA 主要通過從植物中提取、化學(xué)法合成以及微生物酶法轉(zhuǎn)化等方法生產(chǎn)獲得。 LDOPA 生產(chǎn)的國內(nèi)外研究進(jìn)展 1911 年， Casimir Funk 在實(shí)驗(yàn)室中第一次成功合成 D,LDOPA。 Birkmayer 于 1961 年用左旋多巴治療 PD 獲得明顯療效 [2]。未來左旋多巴新給藥方法的思路包括應(yīng)用藥物的新劑型 ,如經(jīng)皮鉆貼劑、鼻腔噴霧劑、咀嚼片以及緩釋劑等 [1]。在帕金森癥狀的治療中 ,左旋多巴比其他所有藥物都更有效 ,這可能是由于其產(chǎn)物（多巴胺）是一 種能同時(shí)作用于紋狀體內(nèi)兩種多巴胺受體的生理性神經(jīng)遞質(zhì) ,而許多激動(dòng)劑僅僅激活 D2 受體。 參考文獻(xiàn) ...................................................................................................................... 16 常州工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院畢業(yè)設(shè)計(jì)（論文） 共 17 頁 第 2 頁 1 前 言 酪氨酸酚裂解酶 左旋多巴又稱 L多巴，為酪氨酸的羥化物，在