臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室臨床實(shí)驗(yàn)報(bào)告管理制度五篇(參考版)
2024-11-04 17:06本頁面
【正文】 如有凝問請咨詢重慶市臨檢中心分子室郭元元，聯(lián)系方式：02363519127。正式驗(yàn)收不合格者，將停止審核，實(shí)驗(yàn)室整改后重新申請驗(yàn)收。試運(yùn)行三個(gè)月后，再組織專家進(jìn)行現(xiàn)場正式驗(yàn)收，此次驗(yàn)收包括標(biāo)本的考核。若文件初審不通過，將通知申請實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行限期整改（一般兩周），整改后再次提交，對文件進(jìn)行再審核，同時(shí)有必要時(shí)將派專家現(xiàn)場去實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行預(yù)驗(yàn)收，考察其設(shè)置、標(biāo)識、文件管理等是否準(zhǔn)備好，預(yù)驗(yàn)收及文件整改通過，則1個(gè)月內(nèi)組織專家對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行現(xiàn)場初審。文件審核階段為收到申請之日起，十五個(gè)工作日內(nèi)給申請實(shí)驗(yàn)室回復(fù)文件審核結(jié)果；文件審核通過，則一個(gè)月內(nèi)組織專家對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行現(xiàn)場初審（專家主要邀請市內(nèi)相關(guān)專家如：三醫(yī)大附屬醫(yī)院及重醫(yī)附屬醫(yī)院等專家），現(xiàn)場初審?fù)ㄟ^，則頒發(fā)初審合格證，允許其三個(gè)月的試運(yùn)行。本工作規(guī)范自公布之日起實(shí)施。多少即可，不能報(bào)告為“0”或“陰性”。定性測定報(bào)告“陽性”或“陰性”即可。(4)測定結(jié)果的評價(jià)與報(bào)告：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，在判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)先對擴(kuò)增的熒光信號作出定性判斷，然后再進(jìn)行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結(jié)果分析的干擾。在擴(kuò)增靶RNA的RTPCR實(shí)驗(yàn)中，可做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴(kuò)增的DNA片段所引起的污染。每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中都必須設(shè)有外加陰性質(zhì)控(污染監(jiān)測質(zhì)控)，為判斷擴(kuò)增過程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個(gè)過程中所帶的空白管、僅有擴(kuò)增反應(yīng)液但不含擴(kuò)增模板的反應(yīng)管、陰性標(biāo)本等。使用這些外加弱陽性質(zhì)控不但可檢測擴(kuò)增反應(yīng)液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。目前的商品試劑盒大部分沒采用內(nèi)標(biāo)方法質(zhì)控。對于病原體的基因檢測，內(nèi)標(biāo)多采用人工制備的競爭性內(nèi)標(biāo)。當(dāng)標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標(biāo)即會表現(xiàn)為陰性結(jié)果。逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增檢測的內(nèi)標(biāo)通常為在整個(gè)細(xì)胞周期中均勻表達(dá)的mRNA，如HLA、 rRNA等。(2)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：本部份包括陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。對于血清（漿）中病毒的測定，則要評價(jià)標(biāo)本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽情況下標(biāo)本處理方法對擴(kuò)增檢測的影響，避免由于標(biāo)本處理方法的不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。但如果對結(jié)果有疑問,就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。僅用光度計(jì)比色方法不能對DNA的完整性下結(jié)論。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計(jì)，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/~。明顯出現(xiàn)降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內(nèi))在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強(qiáng)的熒光信號。(1)標(biāo)本制備：常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發(fā)生降解。室內(nèi)質(zhì)量控制必須對DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)改變。相反，提高溫度和/或降低離子強(qiáng)度會增加雜交的嚴(yán)格性。在擴(kuò)增后的雜交檢測中, 應(yīng)該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉(zhuǎn)錄的反義RNA探針。(八)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗(yàn)項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。去除污染的措施工作完后必須定期對實(shí)驗(yàn)室采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達(dá)到最佳效果。另外一種方法是持續(xù)的長波紫外燈照射，通過異補(bǔ)骨脂素光化學(xué)產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對擴(kuò)增沒有反應(yīng)但又不妨礙PCR后雜交過程，所以這種方法也能防止污染。為避免以前測定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測時(shí)，非常容易引起污染，因此必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，并嚴(yán)格執(zhí)行。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應(yīng)管，吸頭)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備(如加樣器、離心機(jī))等。測定分析階段的污染源通常，測定分析階段的每一步都可能發(fā)生對樣本的污染。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的最主要來源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等；(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。(六)靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴(kuò)增靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的第一個(gè)酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈，為后面擴(kuò)增的模板。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過長。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標(biāo)本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑(如酚、氯仿等)，
環(huán)評公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1