【正文】 本工作規(guī)范自公布之日起實(shí)施。多少即可，不能報(bào)告為0或陰性。定性測定報(bào)告陽性或陰性即可。(4)測定結(jié)果的評價(jià)與報(bào)告：采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法，在判斷結(jié)果時(shí)，應(yīng)先對擴(kuò)增的熒光信號作出定性判斷，然后再進(jìn)行定量分析，避免一些非特異熒光信號對結(jié)果分析的干擾。在擴(kuò)增靶RNA的RTPCR實(shí)驗(yàn)中，可做省略逆轉(zhuǎn)錄的污染質(zhì)控，通過這種方法，可發(fā)現(xiàn)以前擴(kuò)增的DNA片段所引起的污染。每一個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)中都必須設(shè)有外加陰性質(zhì)控(污染監(jiān)測質(zhì)控)，為判斷擴(kuò)增過程中污染出現(xiàn)的階段，陰性質(zhì)控可包括如下幾種，即在樣品制備的整個(gè)過程中所帶的空白管、僅有擴(kuò)增反應(yīng)液但不含擴(kuò)增模板的反應(yīng)管、陰性標(biāo)本等。 使用這些外加弱陽性質(zhì)控不但可檢測擴(kuò)增反應(yīng)液的質(zhì)量，還可獲得有關(guān)PCR試劑的檢測下限和特異性的信息。目前的商品試劑盒大部分沒采用內(nèi)標(biāo)方法質(zhì)控。對于病原體的基因檢測，內(nèi)標(biāo)多采用人工制備的競爭性內(nèi)標(biāo)。當(dāng)標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄抑制物，或核酸提取中發(fā)生RNA降解，或逆轉(zhuǎn)錄酶失活，內(nèi)標(biāo)即會表現(xiàn)為陰性結(jié)果。逆轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增檢測的內(nèi)標(biāo)通常為在整個(gè)細(xì)胞周期中均勻表達(dá)的mRNA，如HLA、 rRNA等。(2)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增：本部份包括陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控。對于血清（漿）中病毒的測定，則要評價(jià)標(biāo)本出現(xiàn)溶血、脂血和黃膽情況下標(biāo)本處理方法對擴(kuò)增檢測的影響，避免由于標(biāo)本處理方法的不當(dāng)而出現(xiàn)假陰性結(jié)果。另外，瓊脂糖凝膠電泳能顯示出在RNA的制備中被DNA污染的程度。如發(fā)生RNA的降解，則出現(xiàn)大量低分子量帶或出現(xiàn)帶的消失。但如果對結(jié)果有疑問,就應(yīng)該在變性的條件下作瓊脂糖凝膠電泳以檢測RNA的完整性。僅用光度計(jì)比色方法不能對DNA的完整性下結(jié)論。潛在的抑制劑的存在通常用260nm和280nm的分光光度測定來估計(jì)，質(zhì)量好的DNA提取物，A260/~。明顯出現(xiàn)降解的DNA(在1和10kb的低分子量范圍內(nèi))在經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離和用溴化乙錠染色后也可見強(qiáng)的熒光信號。(1)標(biāo)本制備： 常用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA提取效果，以判斷所提取的DNA是否發(fā)生降解。室內(nèi)質(zhì)量控制必須對DNA和RNA分析的各步進(jìn)行質(zhì)量控制，以避免假陽性和假陰性，保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。要注意的是，溫度和離子強(qiáng)度不能同時(shí)改變。相反，提高溫度和/或降低離子強(qiáng)度會增加雜交的嚴(yán)格性。在擴(kuò)增后的雜交檢測中, 應(yīng)該嚴(yán)格遵守商品試劑盒確定的雜交程序和雜交條件。最常使用的基因探針有：DNA片段、合成的寡核苷酸和體外轉(zhuǎn)錄的反義RNA探針。(八)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析擴(kuò)增產(chǎn)物的測定有各種方法，如電泳、限制性酶切、斑點(diǎn)印跡、探針雜交、測序、分光光度法定量等，但臨床PCR檢驗(yàn)項(xiàng)目基本上都使用探針雜交方法。去除污染的措施工作完后必須定期對實(shí)驗(yàn)室采取有效的去污染措施，結(jié)合各種不同的方法可達(dá)到最佳效果。另外一種方法是持續(xù)的長波紫外燈照射，通過異補(bǔ)骨脂素光化學(xué)產(chǎn)生DNA加合物，由于DNA加合物對擴(kuò)增沒有反應(yīng)但又不妨礙PCR后雜交過程，所以這種方法也能防止污染。為避免以前測定中所產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物的污染，可設(shè)法將其破壞掉。而在產(chǎn)物分析區(qū)，當(dāng)吸取擴(kuò)增產(chǎn)物用于檢測時(shí)，非常容易引起污染，因此必須制定標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)，并嚴(yán)格執(zhí)行。如受污染的試劑(例如牛血清白蛋白，明膠或礦物油)、商品酶制劑、消耗品(如反應(yīng)管，吸頭)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備(如加樣器、離心機(jī))等。測定分析階段的污染源通常，測定分析階段的每一步都可能發(fā)生對樣本的污染。但如果發(fā)生了污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到發(fā)現(xiàn)了污染源為止，并且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室中污染的最主要來源是擴(kuò)增產(chǎn)物的污染。擴(kuò)增儀孔中熱傳導(dǎo)的均一性極為重要，必須定期對擴(kuò)增儀的溫度控制和加熱模塊中熱傳導(dǎo)的一致性進(jìn)行檢查，以避免假陰性結(jié)果。其可能的原因有逆轉(zhuǎn)錄酶質(zhì)量不高、試劑降解變質(zhì)或加樣錯(cuò)誤等；(2)用于逆轉(zhuǎn)錄的標(biāo)本中存在逆轉(zhuǎn)錄或Taq酶的抑制物(如酚、氯仿、血紅素等)；(3)RNA酶的存在導(dǎo)致RNA的降解。(六)靶核酸的逆轉(zhuǎn)錄(RT)和擴(kuò)增靶RNA的逆轉(zhuǎn)錄 cDNA合成為逆轉(zhuǎn)錄PCR中的第一個(gè)酶反應(yīng)步驟，所產(chǎn)生的cDNA為靶RNA的反向互補(bǔ)鏈，為后面擴(kuò)增的模板。對于前者，要核查測定分析前的步驟，如果發(fā)現(xiàn)有RNA降解的證據(jù)，實(shí)驗(yàn)室則應(yīng)拒絕接受標(biāo)本，要求重新采取標(biāo)本，并對運(yùn)送者給以詳細(xì)的指導(dǎo)。需注意的是，液化時(shí)不能加熱，液化時(shí)間不能過長。通常，核酸制備質(zhì)量不高是由于抑制物去除不完全所致，抑制物可能來源于標(biāo)本本身(如血紅素及其前體或降解產(chǎn)物)或核酸提取過程中殘留的有機(jī)溶劑(如酚、氯仿等)，這些物質(zhì)對其后的Taq酶擴(kuò)增反應(yīng)步驟具有強(qiáng)烈的抑制作用，從而影響靶核酸的擴(kuò)增測定。用GITC處理的RNA標(biāo)本在室溫可保存7天。用于RNA測定的已純化核酸樣本應(yīng)在緩沖液中80℃或液氮中貯存。(四)標(biāo)本的貯存臨床體液標(biāo)本如血清/血漿等可于70℃下長時(shí)間貯存。通常在運(yùn)送時(shí)，應(yīng)采用不易破碎的容器裝載標(biāo)本。經(jīng)過適當(dāng)穩(wěn)定化處理的標(biāo)本可在常溫下通過郵寄運(yùn)送。對于特定的檢測項(xiàng)目，上述穩(wěn)定化處理方法的效果究竟如何，要使用相應(yīng)的逆轉(zhuǎn)錄PCR測定方法來評價(jià)。異硫氰酸胍鹽(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活，因此在采集標(biāo)本時(shí)，可將標(biāo)本材料如血清或血漿按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的試管中，從而使血清(漿)中的RNA酶不可逆失活。(二)標(biāo)本的穩(wěn)定化處理用于DNA擴(kuò)增檢測的標(biāo)本，采集后一般不需要特殊的穩(wěn)定化處理，但標(biāo)本應(yīng)及時(shí)送至實(shí)驗(yàn)室。臨床用于RNA(如HCV RNA)擴(kuò)增檢測的血標(biāo)本建議進(jìn)行抗凝處理，并盡快(3小時(shí)以內(nèi))分離血漿，以避免RNA的降解。EDTA和枸櫞酸鹽是首選的抗凝劑。最好是熱滅菌，250℃烘烤4小時(shí)以上可使RNA酶永久性失活。采樣時(shí)必須戴一次性手套。采血液等樣本時(shí)，應(yīng)使用一次性密閉容器，如真空采血管。二、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量保證涉及到整個(gè)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)的所有階段，即測定分析前的標(biāo)本采集處理、測定中的核酸提取、擴(kuò)增和產(chǎn)物分析以及測定后的結(jié)果報(bào)告等。本區(qū)的清潔消毒和紫外照射方法同前面區(qū)域。用過的吸頭也必須放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序處理，如焚燒。本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此必須注意避免通過本區(qū)的物品及工作服將擴(kuò)增產(chǎn)物帶出。核酸擴(kuò)增后產(chǎn)物的分析方法多種多樣，如膜上或微孔板上探針雜交方法(同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記)、瓊脂糖凝膠電泳、聚丙烯酰胺凝膠電泳、Southern轉(zhuǎn)移、核酸測序方法等。如有溶液濺出，必須處理并作出記錄。用過的加樣器必須注意清潔消毒。可使用體積較小的離心機(jī)，因其所占實(shí)驗(yàn)臺面小，易于用一只手操作，適合于大多數(shù)超凈臺。打開預(yù)處理過的反應(yīng)混合液時(shí)必須防止液體濺出，尤其是在巢式擴(kuò)增步驟之間。 為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的走動。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。 (三)擴(kuò)增區(qū)下述工作在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行：DNA或cDNA擴(kuò)增。cDNA合成的理想溫度依所使用的酶而定，傾向于使用一步法：即使用在擴(kuò)增反應(yīng)緩沖液條件下具有逆轉(zhuǎn)錄活性的熱穩(wěn)定的DNA聚合酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，其較cDNA合成后再開蓋以調(diào)節(jié)緩沖液或加入聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增發(fā)生污染的可能性降低。用于RNA擴(kuò)增檢測的樣本制備好以后，應(yīng)立即進(jìn)行cDNA合成，因?yàn)閏DNA鏈較RNA穩(wěn)定，保存相對容易。可移動紫外線管燈可用來確保工作后對實(shí)驗(yàn)臺面的充分照射。實(shí)驗(yàn)室桌椅表面每次工作后都要清潔，實(shí)驗(yàn)材料(原始血標(biāo)本、血清標(biāo)本、提取中的標(biāo)本與試劑的混合液等)如出現(xiàn)外濺，則必須分別處理并作出記錄。對具有潛在傳染危險(xiǎn)性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序?？赏ㄟ^在本區(qū)內(nèi)設(shè)立正壓條件避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。要正確使用加樣器。實(shí)驗(yàn)室及其設(shè)備的使用必須有日常記錄。由于紫外照射的距離和能量對去污染的效果非常關(guān)鍵，因此可使用可移動紫外燈(254nm波長)，在工作完成后調(diào)至實(shí)驗(yàn)臺上60~90cm內(nèi)照射。本工作區(qū)的實(shí)驗(yàn)臺表面應(yīng)可耐受諸如次氯酸鈉的化學(xué)物質(zhì)的消毒清潔作用。嚴(yán)禁用嘴吸取液體，加樣器和吸頭等必須經(jīng)高壓處理。在整個(gè)本區(qū)的實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。主反應(yīng)混合液的組成成份尤其是聚合酶的適用性和穩(wěn)定性通過預(yù)試驗(yàn)來檢查，評價(jià)結(jié)果必須有書面報(bào)告。為避免因單次反應(yīng)取液而頻繁的凍融主貯存試劑，應(yīng)分裝冰凍貯存試劑溶液。含反應(yīng)混合液的離心管或試管在冰凍前都應(yīng)快速離心數(shù)秒。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。貯存試劑和用于標(biāo)本制備的材料應(yīng)直接運(yùn)送至試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)，不能經(jīng)過產(chǎn)物分析區(qū)。不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防止交叉污染。此外，當(dāng)工作者離開工作區(qū)時(shí)，不得將各區(qū)特定的工作服帶出。進(jìn)入各個(gè)工作區(qū)域必須嚴(yán)格遵循單一方向順序，即只能從試劑貯存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增反應(yīng)混合物配制和擴(kuò)增區(qū)(簡稱擴(kuò)增區(qū))至產(chǎn)物分析區(qū)，避免發(fā)生交叉污染。臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室四個(gè)隔開的工作區(qū)域中每一區(qū)域都須有專用的儀器設(shè)備。一、臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置及其管理臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的規(guī)范化設(shè)置詳見《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》(衛(wèi)醫(yī)發(fā)[2002]10號文)附件《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室基本設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)》。 臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法如何迎接臨床基因