免疫組化、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用比較及常見問題分析(參考版)
2024-10-03 13:52本頁面
【正文】 。進(jìn)樣速度太快，建議調(diào)低進(jìn)樣速度。封閉不完全，建議增加蛋白封閉時(shí)間。一抗種屬來源來源不同。操作過程中沖洗不充分，建議增加沖洗的次數(shù)與沖洗時(shí)間。 第三十四頁，共三十五頁。 流式細(xì)胞術(shù)常見問題分析 第三十二頁，共三十五頁。 進(jìn)樣速度太快，建議調(diào)低進(jìn)樣速度。 二抗選擇錯(cuò)誤〔種屬不匹配〕，建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。 細(xì)胞通透性差，建議增加通透劑的作用時(shí)間或濃度。 洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時(shí)間。 熒光強(qiáng)度 /背景過高 一抗 /二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗 /二抗?jié)舛取? 圖片引自 :// bioon /experiment/cellular4/ 第三十頁，共三十五頁。因此將 Annexin V 與 PI 匹配使用，就可以將細(xì)胞凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開來。 將 Annexin V進(jìn)行熒光素〔 FITC、 PE〕或 Biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin VFITC作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。 Annexin VFITC/PI凋亡檢測原理 在細(xì)胞凋亡早期，磷脂酰絲氨酸〔 Phosphatidylserine， PS〕可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的外表，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。 第二十七頁，共三十五頁。然而，熒光染料所發(fā)出的熒光都具有一定的波長范圍〔寬發(fā)射譜性質(zhì)〕，雖然各自的熒光峰值不同，但發(fā)射譜范圍會(huì)有一定的重疊。 熒光補(bǔ)償示原理 ?熒光補(bǔ)償是指修正熒光滲漏的過程，如從探測器出去除匹配熒光以外的任何熒光信號。 人外周全血細(xì)胞雙參數(shù)散點(diǎn)圖 直方圖：單參數(shù)分析 流式細(xì)胞術(shù)常見結(jié)果分析 第二十五頁，共三十五頁。 第二十三頁，共三十五頁。 細(xì) 胞 抗原 一抗 二抗 熒光物質(zhì)〔 FITC,PE等〕 不同顏色的激發(fā)光 FC反響原理示意圖 激光源 轉(zhuǎn)化為計(jì)算機(jī)識別數(shù)據(jù) 第二十一頁，共三十五頁。 流式細(xì)胞術(shù)〔 FLOW CYTOMETRY〕 : 利用流式細(xì)胞儀對處于快速流動(dòng)的細(xì)胞或生物顆粒進(jìn)行多參數(shù)、快速〔每秒可達(dá) 100010000個(gè)〕的定量分析和分選〔純度可達(dá)99%以上〕的技術(shù)。 細(xì)胞成分中能夠產(chǎn)生自發(fā)熒光的分子〔例如核黃素、細(xì)胞色素等〕的含量高；培養(yǎng)細(xì)胞中死細(xì)胞／活細(xì)胞比例高； 第十九頁，共三十五頁。 免疫熒光常見問題分析 使用了戊二醛固定，建議在固定后熒光染色前進(jìn)行熒光淬滅，如使用 NaIO4， NaBH4，甘氨酸等，染色前檢查自發(fā)熒光。 ?熒光素本身特性決定，光穩(wěn)定性差，建議選用光穩(wěn)定性好的熒光素二抗。 ?洗滌不充分，建議增加沖洗次數(shù)與時(shí)間。 ?一抗 /二抗?jié)舛忍?，建議降低一抗 /二抗?jié)舛取? 二抗選擇錯(cuò)誤〔種屬不匹配〕，建議選用與一抗種屬相匹配的二抗。 細(xì)胞通透性差，建議增加通透劑的作用時(shí)間或濃度。 各種熒光染料原理及選擇 第十八頁，共三十五頁。 熒光抗體的選擇： 綠色熒光素： FITC， Alex488， Dylight488等?？膳c F肌動(dòng)蛋白結(jié)合，使 F肌動(dòng)蛋白保持穩(wěn)定。 PIDNA復(fù)合物的激發(fā)和發(fā)射波長分別為 535nm和 615nm。 碘化丙啶 (PI)是一
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