生物大分子的制備(參考版)
2025-01-01 22:17本頁(yè)面
【正文】 ? ⑥得到最終產(chǎn)品后，必要時(shí)要立即冰凍干燥，分裝并寫明標(biāo)簽，－ 20℃ 或－ 70℃ 保存。 ? 例如吸附不可以放在鹽析之后，以免大量鹽離子影響吸附效率；離子交換要放在凝膠過(guò)濾之前，因?yàn)殡x子交換層析的上樣量可以不受限制，只要不超過(guò)柱交換容量即可。 ? ③必要時(shí)也可以重復(fù)使用同一種分離純化方法，例如：分級(jí)有機(jī)溶劑沉淀、 ? 分級(jí)鹽析、 ? 連續(xù)兩次凝膠過(guò)濾、 ? 離子交換層析等。 ? 2)要注意的一些問題： ? ①鹽析后要及時(shí)脫鹽。 ? ?3)可選用的方法： ? 吸附； ? 萃??； ? 沉淀法（熱變性、鹽析、有機(jī)溶劑沉淀等）； ? 離子交換（批量吸附、胖柱交換）； ? 親和層析等。 ? ③分辨力不必太高。 ? 2)對(duì)所選方法的要求： ? ①要快速、粗放。 ? ③物理化學(xué)性質(zhì)相近的物質(zhì)很多。 ? ? ⑴早期分離純化 ? 1)特點(diǎn)： ? ①粗提取液中物質(zhì)成份十分復(fù)雜。 ? ③以 電荷差異 為依據(jù)的方法：電泳、電滲析、等電點(diǎn)沉淀、吸附層析和離子交換層析等。 ? 分離純化方法的選擇 ? 制備生物大分子的方法可以粗略地分類如下： ? ①以 分子大小和形態(tài)的差異 為依據(jù)的方法：差速離心、區(qū)帶離心、超濾、透析和凝膠過(guò)濾等。 ? ③巰基試劑：一些蛋白質(zhì)和酶的表面或內(nèi)部含有半胱氨酸巰基，易被空氣中的氧緩饅氧化為磺酸或二硫化物而變性，保存時(shí)可加入半胱氨酸或巰基乙醇。常用 MgSO NaCl、 (NH4)SO4等。 ? ? ⑶ 在保護(hù)劑下保存 ： ? ①惰性的生化或有機(jī)物質(zhì)：如糖類、脂肪酸、牛清白蛋白、氨基酸、多元醇等，以保持穩(wěn)定的疏水環(huán)境。 ? ⑵ 制成干粉或結(jié)晶保存 ：蛋白質(zhì)和酶固態(tài)比在溶液中要穩(wěn)定的多。極少數(shù)酶可以耐熱：如核糖核酸酶可以短時(shí)煮沸；胰蛋白酶在稀 HCl中可以耐受 90℃ ；蔗糖酶在 50℃ ～60℃ 可以保持 15 min ～ 30 min不失活。 ? ⑹ 時(shí)間 ：生化和分子生物學(xué)樣品不可能永久存活，不同的樣品有其不同的有效期，因此，保存的樣品必須寫明日期，定期檢查和處理。因此樣品通常都要避光保存。加速氧化、聚合、離解和霉變。 ? ⑶ 水份 ：樣品本身所帶的水份和由空氣中吸收的水份。 ? 影響生物大分子樣品保存的主要因素有： ? ⑴ 空氣 ：空氣空氣的影響主要是潮解、微生物污染和自動(dòng)氧化。 ? ⑥真空泵要經(jīng)常檢查油面和油色，油面過(guò)低和油色發(fā)黑，則需換油。放氣時(shí)要緩慢，以免氣流沖散樣品干粉。 ? ③凍干后要及時(shí)取出樣品，以免樣品在室溫下仃留時(shí)間過(guò)長(zhǎng)而失活。 ? ⑷凍干： ? ①樣品全部?jī)龈汕?，不要輕易搖動(dòng)，以防水蒸汽沖散凍干的樣品粉末。 ? ②凍干稀溶液時(shí)會(huì)得到很輕的絨毛狀固體樣品，容易飛散而損失和造成污染，因而要用刺了孔的薄膜或吸水紙包住杯口，刺的孔不要過(guò)小過(guò)少，否則會(huì)影響凍干速度。 ? ? ⑵裝樣品溶液的容器： ? ①用各種尺寸的培養(yǎng)皿盛樣品溶液，液層不要太厚，可以使用安瓿并和青霉素小并。 ? ③樣品緩沖液在冰凍時(shí) pH可能會(huì)有較大變化需加入 pH穩(wěn)定劑，如糖類和鈣離子等。 ? ⑴樣品溶液： ? ①樣品要溶于水，不含有機(jī)溶劑，否則冰點(diǎn)降低，樣品易融化，起大量泡沫，使樣品變性，污染真空泵油。 ?②得到的干粉樣品不粘壁，易取出。 ? 1克 0℃ 的冰變成 0℃ 的蒸汽需吸熱 580千卡，容器外壁上會(huì)掛霜。冰凍干燥的原理可用溶劑的三相點(diǎn)相圖來(lái)說(shuō)明，見圖 6 ： ? 當(dāng)溫度在三相點(diǎn) O以下，將壓力降至 OC線以下，溶劑（通常是水）就可以由固相直接升華為汽相。 ? 冰凍干燥 ? 冰凍干燥機(jī)是生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室必備的儀器之一，因?yàn)榇蠖鄶?shù)生物大分子分離純化后的最終產(chǎn)品多數(shù)是水溶液，要從水溶液中得到固體產(chǎn)品，最好的辦法就是冰凍干燥，因?yàn)樯锎蠓肿尤菀资Щ?，通常不能使用加熱蒸發(fā)濃縮的方法。 ? 由于超濾法處理的液體多數(shù)是含有水溶性生物大分子、有機(jī)膠體、多糖及微生物等。 ? 超濾裝置由若干超濾組件構(gòu)成。 ? 超濾膜的基本性能指標(biāo)： 水通量 （ cm3/(cm2這種膜在 pH 1～ 14都是穩(wěn)定的，且能在 90℃ 下正常工作。 ? 常用的膜是由 乙酸纖維 或 硝酸纖維 或此二者的混合物制成。對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，一般只能得到 10～ 50％的濃度。 ? 在生物大分子的制備技術(shù)中，超濾主要用于生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。 ? 反滲透 所用的操作壓比超濾更大，常達(dá)到35 105Pa～ 140 105Pa， 膜的平均孔徑最小，一般為 10埃 以下，用于分離小分子溶質(zhì)，如海水脫鹽，制高純水等。 ? 微孔過(guò)濾 所用的操作壓通常小于 4 104Pa，膜的平均孔徑為 500?！?14微米（ 1微米＝ 104埃） ，用于分離較大的微粒、細(xì)菌和污染物等。 ?超濾是一種加壓膜分離技術(shù) ， 即在一定的壓力下 ， 使小分子溶質(zhì)和溶劑穿過(guò)一定孔徑的特制的薄膜 ， 而使大分子溶質(zhì)不能透過(guò) ， 留在膜的一邊 ， 從而使大分子物質(zhì)得到了部分的純化 。 ? 超濾 ? 超過(guò)濾即超濾 ， 自 20年代問世后 ， 直至 60年代以來(lái)發(fā)展迅速 ， 很快由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模的分離手段發(fā)展成重要的工業(yè)單元操作技術(shù) 。截留分子量 MwCO通常為 1萬(wàn)左右。 ? 透析只需要使用專用的半透膜即可完成。 透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室最簡(jiǎn)便最常用的分離純化技術(shù)之一 。 ? ③ 沉淀后有機(jī)聚合物容易去除 。 ? 本方法的優(yōu)點(diǎn)是： ? ① 操作條件溫和 ， 不易引起生物大分子變性 。 近年來(lái)廣泛用于核酸和酶的純化 。 ? 此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。 通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的分離純化步驟 。 通常在冰浴或冷室中進(jìn)行 。 ? ⑴ 熱變性 ? 利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同 ， 加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中 。 ? 沉淀所得的固體樣品 ， 如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離 ， 則應(yīng)盡可能抽干沉淀 ， 減少其中有機(jī)溶劑的含量 ， 如若必要可以裝透析袋透析脫
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