基因工程第五章-載體(參考版)
2024-09-22 20:52本頁面
【正文】 ） 。溶源性在特殊的條件下可實(shí)現(xiàn)向裂解途徑的轉(zhuǎn)變。 裂解途徑：當(dāng) DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，形成環(huán)狀 DNA，進(jìn)行滾環(huán)復(fù)制，并合成頭 /尾。（ ?噬菌體裝配的要求是重組的 DNA分子要保證在 ――50kb 才能進(jìn)行裝配），所以對于大片斷不能采用 ?噬菌體載體。因此，可以利用置換和缺失去除 ?噬菌體 DNA中一些非必要區(qū)，使他能拼接不同長度的外源 DNA片斷。 ? 去除 ?噬菌體 DNA中的非必要區(qū)： ? 經(jīng)過測定， ?噬菌體 DNA中有一半?yún)⒓邮删w的生命活動，即有 50％的基因?qū)κ删w的生長和噬菌斑的形成是必須的。 二、 噬菌體載體的構(gòu)建： 野生 ?噬菌體 DNA不適于用作基因克隆，改造集中于兩個方面： ? 消除多余的限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)： ?噬菌體 DNA作為載體來說，突出的缺點(diǎn)是對大多數(shù)常用的核酸限制性內(nèi)切酶都具有過多的限制性切點(diǎn)，而其中有的切點(diǎn)在基因組的必要區(qū)。 一、 ?噬菌體的 DNA結(jié)構(gòu)特征： ??噬菌體的基因組是一條線性 DNA， DNA分子兩端各有一個由 12個核苷酸組成的互補(bǔ)的 5‘突出的黏性末端，所以，這種線性分子可以發(fā)生環(huán)化，形成閉合的環(huán)狀分子，這個位點(diǎn)成為 cos 位點(diǎn)，即黏性末端。 解決辦法：功能性基因突變 Vector of ? phage Section two ?1974年， Davis發(fā)現(xiàn) ?噬菌體失去一部分 DNA后，仍然不失活，這一部分缺失 DNA的空間正好用來承載外源基因片斷，第一次證明了 ?噬菌體 DNA作為基因無性繁殖載體的可能性。 ? 結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性：質(zhì)粒分子帶有外源基因，外源基因有時會與宿主 DNA進(jìn)行同源重組，另外，一些誘變作用會產(chǎn)生外源 DNA的缺失、插入、重排，再有寄主染色體的轉(zhuǎn)座子也會使基因插入失活。 ? 人工構(gòu)建的質(zhì)粒這個功能區(qū)已經(jīng)缺失，因此，它在細(xì)胞分裂中是隨機(jī)分配的，盡管出現(xiàn)無質(zhì)粒的細(xì)胞的幾率較低，但在一定的條件下，比如 ―― －細(xì)胞分裂較快或營養(yǎng)缺乏的情況下，會出現(xiàn)無質(zhì)粒的細(xì)胞。 五、 質(zhì)粒載體的不穩(wěn)定性： 1. 分離的不穩(wěn)定性：是指在細(xì)胞分裂過程中，有一個細(xì)胞沒有獲得質(zhì)粒 DNA，最終增值成為無質(zhì)粒的菌株，這種菌株由于沒有代謝壓力而具有較快的生長速率，在體系中成為了優(yōu)勢菌群，最后導(dǎo)致質(zhì)粒的丟失，這種現(xiàn)象叫質(zhì)粒分離的不穩(wěn)定性。他們可以使得質(zhì)?？稍诓煌拗鏖g進(jìn)行基因的轉(zhuǎn)移，研究在不同的細(xì)胞中的克隆、表達(dá)的調(diào)控功能。有利于檢測 ?具有多克隆位點(diǎn)，便于片斷的插入。 ?在構(gòu)建 pUC質(zhì)粒載體時僅留下 pBR322的復(fù)制起始起始位點(diǎn)和 AMP抗性基因，分子大大減小，他的拷貝數(shù)可以達(dá)到 500－ 700個 /個細(xì)胞。是在 pBR322質(zhì)粒載體的基礎(chǔ)上，組入了一個帶有多克隆位點(diǎn)的 LacZ’基因，而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的質(zhì)粒載體。氯霉素可以抑制染色體 DNA的復(fù)制（氯霉素可抑制核糖體的活性），所以當(dāng)我們對培養(yǎng)的菌體用氯霉素處理，松弛型質(zhì)粒的 復(fù)制起始功能蛋白穩(wěn)定 ，所以可以繼續(xù)合成質(zhì)粒，而宿主的 復(fù)制起始蛋白不穩(wěn)定 ，半衰期短，所以細(xì)胞在不能分裂的情況下，質(zhì)粒仍能復(fù)制，最后達(dá)到相當(dāng)高的水平。當(dāng)我們把目的基因插入到抗性基因內(nèi)部，抗性基因就會失去活性，即不能進(jìn)行抗性蛋白物質(zhì)的合成，就為我們篩選提供一種標(biāo)記。 優(yōu)點(diǎn)： ? 具有較小的分子量 : 經(jīng)驗(yàn)表明為了避免 DNA分子在純化過程中發(fā)生鏈的斷裂，克隆載體最好不要超過 10kb， pBR32
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