【正文】 本章小結(jié) 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的工藝流程主要包括哪些步驟？ 微載體的選擇有何要求？ 動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)有幾種操作方式？各自具有哪些特點(diǎn)？ 。取出部分培養(yǎng)基時(shí)， 絕大部分細(xì)胞通過細(xì)胞截流裝置保留在反應(yīng)器內(nèi) 。 細(xì)胞可在 穩(wěn)定狀態(tài)下生長 ，環(huán)境條件如營養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、 pH可恒定，可 有效延長細(xì)胞的對數(shù)生長期 。 特點(diǎn) ：（ 1）培養(yǎng)物的體積逐步增加； （ 2）可進(jìn)行多次收獲； （ 3）細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長，保持產(chǎn)物和細(xì)胞在較高的濃度水平，培養(yǎng)過程可延續(xù)很長時(shí)間。 半連續(xù)式培養(yǎng) 也稱為重復(fù)批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。 流加式培養(yǎng) 關(guān)鍵技術(shù)是在 細(xì)胞指數(shù)生長后期進(jìn)入衰退期之前添加高濃度的營養(yǎng)物質(zhì)，可添加一次，也可多次。 流加式培養(yǎng) 將 終體積 1/3～ 1/2的培養(yǎng)液裝入反應(yīng)器中，適宜條件下接種細(xì)胞，培養(yǎng)過程中 流加濃縮的營養(yǎng)物或培養(yǎng)液 ，使細(xì)胞持續(xù)生長至 較高密度 、目標(biāo)產(chǎn)品達(dá)到 較高水平 。 周期為 3~5d， 細(xì)胞經(jīng)歷對數(shù)生長期，密度達(dá)到最高值后，由于營養(yǎng)物質(zhì)耗盡或代謝產(chǎn)物累積，細(xì)胞進(jìn)入衰亡期。 在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中要考慮使用較溫和的固定化方法，如 吸附培養(yǎng)法、包埋培養(yǎng)法和微囊培養(yǎng)法 。 固定化培養(yǎng) 將 動(dòng)物細(xì)胞 與 水不溶性載體 結(jié)合起來再進(jìn)行培養(yǎng)的方法。 為克服傳統(tǒng)的實(shí)心微載體的不足，現(xiàn)開發(fā)出 大孔微載體 。 接種與收獲方便 ，可循環(huán)、連續(xù)收獲與培養(yǎng)， 培養(yǎng)基 利用率較高 。 可用簡單的顯微鏡 觀察細(xì)胞 在微珠表面的 生長情況 。 微載體培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 表面積／體積大 ，單位體積培養(yǎng)液的 細(xì)胞產(chǎn)率高 。 細(xì)胞收獲階段： 排干培養(yǎng)液，緩沖液漂洗 1次，加入酶，快速攪拌，解離收集細(xì)胞及其產(chǎn)品。 維持培養(yǎng)階段： 隨細(xì)胞增殖，微球變重，增加攪拌速率。 培養(yǎng)初期階段： 保證培養(yǎng)基與微載體處于穩(wěn)定的 pＨ和溫度，對數(shù)生長期細(xì)胞接種至 1/3體積的培養(yǎng)基中。 知識點(diǎn)回顧 微載體培養(yǎng)的操作過程： 微載體培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞也經(jīng)過以上四步。 停滯期 ：細(xì)胞長滿載體表面，隨著營養(yǎng)物消耗和代謝物積累， 密度抑制現(xiàn)象 出現(xiàn)，細(xì)胞開始退化。 對數(shù)生長期 ：懸浮細(xì)胞貼壁后經(jīng)過一段停滯后開始分裂。 動(dòng)物細(xì)胞貼壁生長的主要環(huán)節(jié)有哪些？ 潛伏期 ： （ 1）游離期：接種的細(xì)胞在培養(yǎng)液中呈 懸浮狀態(tài) 。 微載體使利用生物反應(yīng)器進(jìn)行動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)成為可能，既能 滿足動(dòng)物細(xì)胞的貼壁要求 ，又能充分 利用生物反應(yīng)器的內(nèi)部空間 。 一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。 (a)向培養(yǎng)室內(nèi)灌注培養(yǎng)液，培養(yǎng)液在各培養(yǎng)小室之間流動(dòng) ； (b)細(xì)胞工廠轉(zhuǎn)動(dòng) 90。一段時(shí)間后細(xì)胞占據(jù)中空纖維外壁所有空間，并 在纖維表面堆積 。 細(xì)胞 接種到中空纖維的 外表面 ，而充氧的培養(yǎng)液 灌流到中空纖維的 內(nèi)腔 。 中空纖維是 細(xì)微的管狀結(jié)構(gòu) ，管壁為極薄的 半透膜 ，水分子、小分子營養(yǎng)物質(zhì)和氣體可以通過。 兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn) （ 1）旋轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng) 細(xì)胞貼附在轉(zhuǎn)瓶或轉(zhuǎn)管的內(nèi)表面，培養(yǎng)液隨旋轉(zhuǎn)而流動(dòng)， 細(xì)胞交替接觸營養(yǎng)和空氣 ，利于細(xì)胞吸收營養(yǎng)、進(jìn)行氣體交換。 ◆ 貼壁培養(yǎng)的缺點(diǎn)： 擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難，投資大，占地面積大；不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長。其中 微載體培養(yǎng)兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)，是目前公認(rèn)的最有發(fā)展前途的一種動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)。 攪拌式生物反應(yīng)器 氣升式生物反應(yīng)器 貼壁培養(yǎng) 指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。 ◆ 懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)： 操作簡便，培養(yǎng)條件比較均一，傳質(zhì)和傳氧效果比較好，容易擴(kuò)大培養(yǎng)規(guī)模，在培養(yǎng)設(shè)備的設(shè)計(jì)和實(shí)際操作中可以借鑒許多細(xì)菌發(fā)酵的經(jīng)驗(yàn)。 ◆ 主要用于非貼壁依賴型細(xì)胞培養(yǎng)，雜交瘤細(xì)胞、血液白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、某些腫瘤細(xì)胞等屬于此類細(xì)胞。 生產(chǎn)干擾素 生產(chǎn)多肽和蛋白質(zhì)類藥物 生產(chǎn)人源化單克隆抗體 （三）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的一般工藝流程 1 — 組織塊； 2— 組織塊碎片；3— 消化； 4— 離心； 5— 原代培養(yǎng)； 6— 傳代培養(yǎng)； 7— 液氮罐保存細(xì)胞； 8— 復(fù)蘇培養(yǎng)； 9—擴(kuò)大培養(yǎng)； 10— 大規(guī)模生物反應(yīng)器培養(yǎng) 二、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法和操作方式 （一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)的方法 根據(jù)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性不同，可采用 懸浮培養(yǎng) 、 貼壁培養(yǎng) 和 固定化培養(yǎng) 三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。 二、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展 培養(yǎng)器材的發(fā)展 培養(yǎng)方法的發(fā)展 ◆雙蓋片懸滴培養(yǎng)法 ◆旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng)的方法 ◆灌注小室培養(yǎng)法 方便了更換培養(yǎng)液的操作，大大降低了污染的概率 培養(yǎng)物可交替地接觸培養(yǎng)液和氣體環(huán)境，利于細(xì)胞或組織成長 供新鮮培養(yǎng)液流入小室和舊培養(yǎng)液排出，從而使細(xì)胞生活在不斷更新的培養(yǎng)液中 3．培養(yǎng)液的發(fā)展 天然培養(yǎng)基 (胎汁、血漿和血清 ) 人工合成培養(yǎng)基（ 需添加血清 ） 無血清細(xì)胞培養(yǎng)基（用激素、生長因子替代血清） 、培養(yǎng)液的發(fā)展天然培養(yǎng)基 胎汁、血漿和血清人工合成培養(yǎng)基（ 需添加血清 ）無血清細(xì)胞培養(yǎng)基（用激素、生長因子替代血清）第二節(jié) 動(dòng)物細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng) 一、動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)概述 （一）動(dòng)物細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的概念 指在 人工條件 （除滿足培養(yǎng)過程必需的營養(yǎng)要求外，還要進(jìn)行 pH和溶解氧的最佳控制）下，在 細(xì)胞生物反應(yīng)器 中 高 密度大量培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞 用于 生產(chǎn)生物制品 的技術(shù)。 課后問題：查閱文獻(xiàn)論述人源化單克隆抗體的研究進(jìn)展。例