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正文內(nèi)容

基因工程簡答題總結(jié)(參考版)

2025-08-08 20:45本頁面
  

【正文】 )(4)cDNA與載體連接:(5)噬菌體顆粒的包裝及轉(zhuǎn)染或質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化(導(dǎo)入宿主中繁殖)基因的化學(xué)合成:寡核苷酸單鏈的化學(xué)合成;探針的化學(xué)合成;連接子和接頭的合成;基因的半合成;全長基因化學(xué)合成目的基因的分離:目的序列已知:一般采用PCR技術(shù)或分子雜交技術(shù)分離克隆目的基因目的序列未知:差異表達(dá)序列;無差異表達(dá)的目的序列,可采用文庫篩選法、功能蛋白分離法、序列克隆法 第七章高等動(dòng)物基因工程基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)的方法物理方法:裸DNA直接注射、電穿孔、顯微注射化學(xué)方法:磷酸鈣共沉淀、DEAE葡聚糖法、陽離子脂質(zhì)體法、陽離子質(zhì)粒復(fù)合物法生物學(xué)方法——?jiǎng)游锊《据d體:腺病毒、 SV腺相關(guān)病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、人牛痘病毒、皰疹病毒等。cDNA文庫的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):分離的目的基因可直接用于表達(dá);比DNA文庫小的多,容易構(gòu)建缺點(diǎn):只與編碼序列有關(guān);不能反映內(nèi)含子;不能反映啟動(dòng)子、終止子以及與核糖體識(shí)別的序列構(gòu)建cDNA文庫的一般步驟:(1)總RNA(total RNA)提?。?)mRNA的分離純化①原理:利用mRNA都含有一段polyA尾巴,將mRNA從總RNA(rRNA、tRNA等)中分離純化。cDNA文庫:某種生物基因組轉(zhuǎn)錄的的全部mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的各種cDNA分別與克隆載體重組,貯存在一個(gè)受體菌的群體中,這個(gè)群體就稱為cDNA文庫。載體的選擇:λ噬菌體,YAC,BAC,粘粒等。五、問答題(每題 8 分,共 16 分)。缺點(diǎn):缺乏強(qiáng)有力的啟動(dòng)子,分泌效率差,表達(dá)菌株不夠穩(wěn)定,表達(dá)質(zhì)粒易于丟失等例如甲醇酵母系統(tǒng),利用甲醇作為唯一碳源。(4) 雜交后可用RNase消化掉未雜交的RNA,因此降低了本底。(2) 單鏈RNA 由于不存在互補(bǔ)雙鏈的競爭性結(jié)合,所以雜交效率比較高。 13.單鏈RNA 作為探針,具有哪些單鏈DNA 探針?biāo)鶝]有的優(yōu)點(diǎn)?答:單鏈RNA 探針的下列優(yōu)點(diǎn)是單鏈DNA 探針?biāo)鶝]有的:(1) RNA/RNA 和RNA/DNA 比DNA/DNA 雜交體具有更高的穩(wěn)定性。(2) 假定你獲得了綿羊的胰島素mRNA,如何進(jìn)一步從人的cDNA文庫中獲得含人胰島素的克隆并使之在E. coli 中表達(dá)?提示:(1) 首先對該蛋白質(zhì)進(jìn)行部分測序,然后根據(jù)測得的氨基酸序列設(shè)計(jì)簡并引物。10.在基因工程中,為了在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)真核生物的基因產(chǎn)物,為什么通常要用cDNA而不用基因組DNA? 為什么要在cDNA前加上細(xì)菌的啟動(dòng)子?答:這是因?yàn)榧?xì)菌沒有內(nèi)含子剪接系統(tǒng),并且不能識(shí)別真核生物的啟動(dòng)子的原因。用該酶切割后,用DNA 聚合酶將單鏈末端補(bǔ)齊為雙鏈的平末端,然后重新連接成環(huán),轉(zhuǎn)化Lac Tet 受體菌,篩選Tetr轉(zhuǎn)化子,問:Lac 的基因型是什么?并說明原因。提示:因?yàn)镠indH I 的切點(diǎn)位于A 基因內(nèi)。5.用EcoR I 和Hind III 分別切割同一來源的染色體DNA,并進(jìn)行克隆。(1) 利用哪一種抗生素抗性選擇接受了質(zhì)粒的細(xì)胞?(2) 怎樣區(qū)分接受了插入酵母DNA 的質(zhì)粒的克?。刻崾荆?1) 選擇Ampr的轉(zhuǎn)化子;(2) 所需的克隆是Ampr和Kans。 4.一個(gè)攜帶有氨芐和卡那霉素抗性基因的質(zhì)粒被僅在卡那霉素基因中有識(shí)別位點(diǎn)的EcoR I 消化。3.插入失活法和插入表達(dá)法篩選重組體的主要差別是什么?答:主要差別是:(1) 插入失活法是直接根據(jù)失活基因的表型變化來篩選重組體。③在緊接啟動(dòng)子的下游安排限制性位點(diǎn),用于插入需表達(dá)的基因。(2)表達(dá)載體還應(yīng)具有以下組成元件:①攜帶能在寄主細(xì)胞中維持的復(fù)制的起始點(diǎn)。(4) 可用Pst I 和Hind III 雙酶切割基因組DNA 和表達(dá)載體DNA,這種切割可將基因組DNA 片段定向克隆入表達(dá)載體。插入,即5’端必須緊挨啟動(dòng)子。(2) 主要是插入的方向問題。請根據(jù)此圖,回答下列問題:(1) 給出限制性內(nèi)切核酸酶Pst I、BamH I、EcoR I、HindH I 和Cla I 所在部位的遺傳學(xué)名稱。 10.從基因組DNA 文庫中分離的一段DNA(如下圖所示),其中有一編碼基因(黑框),圖中給出了幾種限制性內(nèi)切核酸酶的作用位點(diǎn)。(4) 連接處理過的末端可以再產(chǎn)生Pst I 的位點(diǎn),但不會(huì)產(chǎn)生BamH I 的位點(diǎn)(畫圖說明)。BamH I 的末端可以滿足這些條件,但Pst I 的末端卻不能,因其具有隱蔽的5’端,這種末端是不能作為引物的,故不能被填補(bǔ)。)(4) 在(3)中的連接后,能夠重新形成BamH I 位點(diǎn)嗎?Pst I 位點(diǎn)呢?為什么?答:(1) 切割后分子的5’和3’端 (如圖示):(2) 如圖所示,BamH I 的末端能夠被DNA 聚合酶填補(bǔ),而Pst I 的末端卻不能。 9.限制性內(nèi)切核酸酶BamH I 和Pst I 切割某一DNA 序列,結(jié)果如下所示。 8.某一質(zhì)粒載體具有Tetr和Kanr的表型,在Kan抗性基因內(nèi)有一Bgl I 的酶切位點(diǎn)。 6.如何使用甲基化酶對克隆DNA 進(jìn)行保護(hù)?有什么意義?答:在構(gòu)建基因文庫時(shí),可用與接頭中限制性內(nèi)切核酸酶相應(yīng)的甲基化酶對克隆DNA 先進(jìn)行甲基化修飾,將插入片段上該酶可能的識(shí)別序列先行保護(hù)起來。(2) 基因組文庫克隆的是全部遺傳信息,不受時(shí)空影響;cDNA文庫克隆的是不完全的編碼 DNA 序列,因它受發(fā)育和調(diào)控因子的影響。所以,cDNA文庫是不可能構(gòu)建得十分完全的,也就是說,任何一個(gè)cDNA文庫都不可能包含某一生物的全部編碼基因。由于cDNA技術(shù)合成的是不含內(nèi)含子的功能基因,因此是克隆真核生物基因的一種通用方法。cDNA文庫是以某一生物的總mRNA 為模板,在無細(xì)胞系統(tǒng)中,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,首先合成一互補(bǔ)的DNA,即第一鏈,破壞RNA 模板后,再以第一鏈為模板合成第二鏈,得到的雙鏈DNA 稱為cDNA。在基因組文庫的構(gòu)建中,由于使用的載體不同,分為噬菌體載體和黏粒載體構(gòu)建的基因組文庫、YAC 文庫、BAC 文庫等?;蚪M文庫同遺傳學(xué)上所講的基因庫是完全不同的概念。3.什么是基因組文庫(genomic library)?它同遺傳學(xué)上的基因庫有什么不同?答:基因組文庫是用基因工程的方法,人工構(gòu)建的含有某一生物基因組DNA 的各種片段的克隆群。這種片段就可以插入到任何EcoR I 的限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)中。 ③包裝過程復(fù)雜,包裝效率不穩(wěn)定,代價(jià)高。 ②含不同重組 DNA 片段的菌落生長速度不同,會(huì)造成同一個(gè)平板上菌落大小不一。⑧感染后形成菌落,而不是噬菌斑。重組體只有達(dá)到3245kb 才能有效包裝體外包裝,這就提供了對重組體的正向選擇。如果載體的分子質(zhì)量在5kb 的話,得到的轉(zhuǎn)導(dǎo)子幾乎排除由載體自連的可能性,因?yàn)橐怀晒Πb,至少要7 個(gè)分子的載體自連。 ⑥簡化了篩選。⑤包裝后形成的λ顆粒用來感染大腸桿菌,重組DNA 像λ DNA 一樣注入細(xì)菌細(xì)胞,并以COS位點(diǎn)環(huán)化。④具有λ噬菌體的包裝和轉(zhuǎn)導(dǎo)特性。②具有質(zhì)粒載體的抗生素抗性基因的選擇標(biāo)記和克隆位點(diǎn)。 7.黏粒載體具有哪些特點(diǎn)與不足?答:主要特點(diǎn)有:①柯斯質(zhì)粒是含有λ噬菌體 COS 位點(diǎn)的質(zhì)粒載體。一般說,克隆的片段越大,發(fā)生丟失的概率越大。(3) 單鏈DNA 和雙鏈DNA 都可以轉(zhuǎn)染宿主,并可根據(jù)人工加上的選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選。有報(bào)道,有些噬
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