【正文】 C(The given numbers of the equation were calculated according to a standard(The given numbers of the equation were calculated according to a standard equation for hybridization solutions containing formamide, 50%.) The actual hybridization temperature Topt. for hybridization with DIG Easy Hyb is 2025176。4. colorsubstrate solution要新鮮配制。2. 核酸轉(zhuǎn)移的選擇尼龍膜比NC膜好，是目前較理想的核酸固相支持膜。8. 照相記錄，80℃烤干，儲(chǔ)存。6. 將尼龍膜置于10ml colorsubstrate solution 棕色瓶中，避光數(shù)min至1天（出現(xiàn)顏色時(shí)不要搖動(dòng)）。3. 100ml antibody buffer(1:5000)孵育30min。 七、雜交檢測(cè)（一）、試劑及材料1. Washing buffer2. maleic acid buffer`3. detection buffer4. TEbuffer5. blocking buffer (見(jiàn)DNA探針標(biāo)記實(shí)驗(yàn))6. antibody buffer7. colorsubstrate solution（二）、操作步驟1. Washing buffer潤(rùn)洗1遍（35min）。4. 2SSC（in 0.％SDS）洗膜2次（5min2）.不斷搖動(dòng)。2. 探針變性：DIG標(biāo)記探針煮沸5min后迅速置于碎冰中，用預(yù)熱DIG Easy Hyb工作液制備含探針的雜交液。6. 轉(zhuǎn)移完畢后取出尼龍膜，2SSC浸泡5min，濾紙吸干，夾在2層干凈濾紙。3. 毛細(xì)管法轉(zhuǎn)移：根據(jù)凝膠大小裁剪與其等大小尼龍膜、濾紙片，尼龍膜一角軟鉛筆作方位標(biāo)記4. 去離子水浸泡尼龍膜、濾紙片，中再浸泡5min。 微型水平瓊脂糖電泳槽效果圖 五、DNA轉(zhuǎn)移與固定（一）、試劑及材料1. 2M HCl2. 變性液（ NaOH）3. 20SSC轉(zhuǎn)移液（3mol/L NaCl, ,用1mol/L HCl 調(diào)節(jié)pH ）4. 轉(zhuǎn)移槽5. 吸水紙及濾紙、尼龍膜等（二）、操作步驟1. HCl中處理30min，去離子水洗1次。3. 將DNA樣品用6DNA landing buffer 混勻后加入樣品孔中，恒壓電泳（20V/10mA）直至染料電泳至邊緣。3. 置于PCR議上37℃反應(yīng)過(guò)夜4. 加1/10體積乙酸鈉、2體積無(wú)水乙醇沉淀DNA晾干5. 加20ulTE buffer溶解DNA四、DNA瓊脂糖凝膠電泳（一）、試劑及材料1. 電泳級(jí)瓊脂糖2. 10TBE （ Tris base, 硼酸, 20mM EDTA）3. 10mg/mlEB （誘變劑，4℃避光保存）4. DNA酶切樣本5. 6DNA landing buffer （% 溴酚藍(lán)，40%蔗糖水溶液）6. 水平電泳儀（二）、操作步驟1. TBE ％瓊脂糖凝膠，微波爐加熱至溶化，加入EB（）混勻后倒入制膠器中室溫凝固。該檢測(cè)對(duì)象可以是克隆化的基因組DNA，也可以是細(xì)胞總DNA 或總RNA。雜交過(guò)程是高度特異性的，可以根據(jù)所使用的探針已知序列進(jìn)行特異性的靶序列檢測(cè)。以32P標(biāo)記放射性探針為例，放射自顯影觀察結(jié)果。6. 可根據(jù)下表標(biāo)記產(chǎn)物DNA摸板量（ng） 標(biāo)記1小時(shí)產(chǎn)物（ng） 標(biāo)記20小時(shí)產(chǎn)物（ng）10 45 60030 130 1050100 270 1500300 450 200010000 850 23003000 1350 2650 分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)９ 實(shí)驗(yàn)十七 Southern blot一、目的學(xué)習(xí)Southern blot技術(shù)及其應(yīng)用二、概述，電泳分離，再變性，印跡到硝酸纖維（NC）濾膜上，用探針進(jìn)行雜交，檢測(cè)DNA的方法。100bp。五、注意事項(xiàng)1. 用于標(biāo)記的DNA模板盡可能純化，以提高標(biāo)記效率2. 模板DNAamp。gt。5. 加2ul EDTA終止反應(yīng)，標(biāo)記結(jié)束。3. 加4 ul DIGRandom Labeling Mix，混勻后離心2000rpm5min（4℃）。四、操作步驟1. 滅菌去離子水稀釋1ug DNA至總體積16ul。 % (v/v) Tween 20)7. Maleic acid buffer ( M Maleic acid, M NaCl。 pH (20176。由于同位素標(biāo)記的探針在使用過(guò)程中存在著上述缺點(diǎn)，近年來(lái)，人們?cè)趯ふ曳欠派湫詷?biāo)記物方面取得了很大進(jìn)展。32P因其能量高，信號(hào)強(qiáng)，所以最常用。放射性同位素標(biāo)記是最早采用的也是目前最常用的核酸探針標(biāo)記方法。利用分子雜交這一特性來(lái)對(duì)特定核酸序列進(jìn)行檢測(cè)，必須將雜交鏈中的一條用某種可以檢測(cè)的進(jìn)行標(biāo)記，這條鏈就稱為核酸探針。為了避免因污染而造成的假陽(yáng)性，PCR操作時(shí)要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑、簡(jiǎn)化操作程序，使用一次性吸頭。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。3. 結(jié)果假陽(yáng)性：PCR結(jié)果的假陽(yáng)性是對(duì)被檢測(cè)標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實(shí)的。在進(jìn)行PCR操作時(shí)應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補(bǔ)，尤其是要絕對(duì)保證引物的3′端與靶基因的互補(bǔ)。同時(shí)在提取PCR模板時(shí)，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚、氯仿）的存在。如果沒(méi)有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確，采集標(biāo)本是否有問(wèn)題。2) 引物的分子量=堿基數(shù)3303) 引物pmol數(shù)=OD值331000 000= OD值1000 004) 堿基數(shù)330 堿基數(shù)3302. 結(jié)果假陰性：出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見(jiàn)的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制；引物設(shè)計(jì)不合理；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過(guò)關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠。因此，需經(jīng)適當(dāng)換算，才能配置適當(dāng)濃度的引物溶液。4. 將溫育后產(chǎn)物cDNA取出一部分按照以DNA為模板的PCR擴(kuò)增反應(yīng)步驟進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增反應(yīng)。2. 將溶液混勻，以15 000r/min離心10秒鐘，將反應(yīng)混合液置65℃變性5 min，使mRNA均變?yōu)閱捂湣?. 從反應(yīng)混合液中取出擴(kuò)增產(chǎn)物DNA進(jìn)行凝膠電泳、Southern雜交或DNA序列測(cè)定分析。4. 按以下方法進(jìn)行擴(kuò)增。8) 用滅菌雙蒸餾水補(bǔ)足體積至50 ul2. 將溶液混勻，15 000r/min離心10秒鐘。盡管如此，仍值得按已知靶序列量遞減(1ng、)的方式設(shè)置一組對(duì)照反應(yīng)，以檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)的靈敏度是否符合要求。雖然DNA的大小并不是關(guān)鍵的因素，但當(dāng)使用極高分子量的DNA(如基因組DNA)時(shí)，若用切點(diǎn)罕見(jiàn)的限制酶(Sal I 或Not I)先進(jìn)行消化，則擴(kuò)增效果更好，閉環(huán)靶序列DNA的擴(kuò)增效率略低于線狀DNA，因此用質(zhì)粒作反應(yīng)模板時(shí)最好先將其線狀化，但這也不是非常必要。該法還可用于低豐度mRNA的cDNA文庫(kù)的構(gòu)建及特異cD－NA的克隆，并有可能與Taq酶的測(cè)序技術(shù)相組合，使得自動(dòng)反轉(zhuǎn)錄、基因擴(kuò)增與基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的測(cè)序在一個(gè)試管中進(jìn)行。發(fā)現(xiàn)Taq酶不僅具有DNA多聚酶的作用，而且具有反轉(zhuǎn)錄酶活性，可利用其雙重作用在同一體系中直接以mRNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和其后的PCR擴(kuò)增，從而使mRNA的PCR步驟更為簡(jiǎn)化，所需樣品量減少到最低限度，臨床小樣品的檢測(cè)非常有利。一般情況下用MoMLVRT較多，但模板RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)嚴(yán)重影響逆轉(zhuǎn)錄時(shí)，可改用AMVRT，因后者最適溫度為72℃，高于MoMLVRT的最適溫度（37℃），而較高的反應(yīng)溫度有助于消除RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。硫氰酸胍（GaSCN）CsCl法或酸性硫氰酸胍酚氯仿法可提得理想的RNA制品，尤以后者方法為佳，適合一般實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。但RTPCR對(duì)RNA制品的要求極為嚴(yán)格，作為模板的RNA分子必須是完整的，并且不含DNA、蛋白質(zhì)和其它雜質(zhì)。在RTPCR中關(guān)鍵步驟是RNA的逆轉(zhuǎn)錄，cDNA的PCR與一般PCR條件一樣。RNA的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RTPCR）是以RNA為模板，聯(lián)合逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（reverse transcrip－tion, RT）與PCR，可用于檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞或少數(shù)細(xì)胞中少于10個(gè)拷貝的特異DNA，為RNA病毒檢測(cè)提供了方便；并為獲得與擴(kuò)增特定的RNA互補(bǔ)的cDNA提供了一條極為有利和有效的途徑。 (2) 退火(Anneal):兩種寡核苷酸引物在適當(dāng)溫度(50℃左右)下與模板上的目的序列通過(guò)氫鍵配對(duì)。一般情況下，這兩段寡核苷酸引物的序列互不相同，并分別與模板DNA兩條鏈上的各一段序列互補(bǔ)，而這兩段模板序列又分別位于待擴(kuò)增的兩側(cè)。 分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)８ 實(shí)驗(yàn)十五 PCR及RTPCR一、目的掌握聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR) 及逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RTPCR)的基本方法二、原理PCR用于擴(kuò)增位于兩段已知序列之間的DNA區(qū)段。但它們的轉(zhuǎn)化效率并不一定一樣。4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經(jīng)高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入, 為以后的篩選、鑒定帶來(lái)不必要的麻煩。2. 質(zhì)粒的質(zhì)量和濃度: 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)DNA(cccDNA)。DH5α菌株的OD600 ,細(xì)胞密度在5107 個(gè)/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時(shí)比較合適。2. 轉(zhuǎn)化后在含抗生素的平板上長(zhǎng)出的菌落即為轉(zhuǎn)化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計(jì)算出轉(zhuǎn)化子總數(shù)和轉(zhuǎn)化頻率，公式如下：1) 轉(zhuǎn)化子總數(shù)＝菌落數(shù)稀釋倍數(shù)轉(zhuǎn)化反應(yīng)原液總體積／涂板菌液體積2) 轉(zhuǎn)化頻率（轉(zhuǎn)化子數(shù)／每mg質(zhì)粒DNA）＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／質(zhì)粒DNA加入量(mg)3) 感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)＝對(duì)照組２菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積／涂板菌液體積4) 感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率＝轉(zhuǎn)化子總數(shù)／感受態(tài)細(xì)胞總數(shù)五、注意事項(xiàng)1. 細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和密度: 不要用經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接或儲(chǔ)于４℃的培養(yǎng)菌，最好從－70℃或20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。b) 對(duì)照組2: 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液,但涂板時(shí)只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應(yīng)產(chǎn)生大量菌落。6. 同時(shí)做兩個(gè)對(duì)照:a) 對(duì)照組1: 以同體積的無(wú)菌雙蒸水代替DNA溶液,其它操作與上面相同。4. 向管中加入1ml LB液體培養(yǎng)基(不含Amp),混勻后37℃振蕩培養(yǎng)1小時(shí),使細(xì)菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài),并表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因(Ampr )。2. 加入pBS質(zhì)粒DNA溶液(含量不超過(guò)50ng,體積不超過(guò)10μl),輕輕搖勻,冰上放置30分鐘后。4. 感受態(tài)細(xì)胞分裝成200μl的小份,貯存于70℃可保存半年。2. 棄去上清,冰上放置1530分鐘后,4℃下3000g離心10分鐘。2. 將該菌懸液以1:1001:50的比例接種于100ml LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)23小時(shí)至OD600 ＝。5. 含15%: CaCl2(無(wú)水,分析純),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高壓滅菌。（二）、設(shè)備恒溫?fù)u床電熱恒溫培養(yǎng)箱臺(tái)式高速離心機(jī)無(wú)菌工作臺(tái)低溫冰箱恒溫水浴鍋制冰機(jī)分光光度計(jì)微量移液槍。實(shí)驗(yàn)十四 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備一、目的掌握大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備二、概 述在自然條件下,很多質(zhì)粒都可通過(guò)細(xì)菌接合作用轉(zhuǎn)移到新的宿主。IPTG是異丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside），為非生理性的誘導(dǎo)物，它可以誘導(dǎo)lacZ的表達(dá)。但需及時(shí)挑取白色菌落，當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，白色菌落會(huì)逐漸變成微紅色，影響挑選。6. LB選擇性瓊脂組成的平板，在含有適當(dāng)抗生素時(shí)，攜有載體DNA的轉(zhuǎn)化子為淡紅色菌落，而攜有帶插入片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子為白色菌落。4. 粘性末端形成的氫鍵在低溫下更加穩(wěn)定，所以盡管T4 DNA連接酶的最適反應(yīng)溫度為37℃，在連接粘性末端時(shí)，反應(yīng)溫度以1016℃為好，平齊末端則以1520℃為好。2. 在連接帶有粘性末端的DNA片段時(shí)，DNA濃度一般為210mg/ml，在連接平齊末端時(shí)，需加入