【正文】 準備完畢，在凝固的瓊脂平板上迅速把含厭氧菌樣品進行劃線，然后蓋上皿蓋并密封，搖動平皿使焦性沒食子酸固體和NaOH溶液混合，發(fā)生化學反應，除去皿內(nèi)的氧氣，置適宜溫度下進行培養(yǎng)。 要除去100ml空氣中的氧氣需要焦性沒食子酸固體1g和10%NaOH溶液10ml。（二）焦性沒食子酸法 焦性沒食子酸和NaOH互相反應除去氧氣。它們生長于水底層及沉積物中，要從樣品中分離這類菌，需采取厭氣培養(yǎng)法，否則菌體因接觸氧氣而死亡。三、厭氣菌的分離 好氣菌要在有氧條件下培養(yǎng)，嫌氣菌要在厭氧狀況下才能生長。當從樣品中分離各種菌類時，分別置于自身最適溫度下培養(yǎng)也可大體上抑制另一些微生物的生長。其中不同類群微生物對溫度又有所差別，一般細菌、放線菌最適溫度為25～37℃，霉菌和酵母最適溫度為20～28℃。這類微生物最為常見，、數(shù)量都占首位。如果要分離這類菌可將分離培養(yǎng)基置于50～60℃溫度下培養(yǎng)，能抑制一些嗜冷、中性微生物生長，可以有效地分離到高溫菌類。 控制培養(yǎng)溫度，也是一種獲得目的微生物的有效措施。 一般用于分離單一目的微生物的培養(yǎng)基中均含有抑制其他微生物的抑制劑，這些專用的抑制劑在小型實驗室配制較麻煩，現(xiàn)已有成品供應，只要直接加入基礎培養(yǎng)基即可。（3）分離霉菌和酵母菌時，在培養(yǎng)基中加入青霉素、鏈霉素和四環(huán)素各30U/ml，可以抑制細菌和放線菌生長。（2）分離放線菌時，%十二烷基磺酸鈉（SDS）不僅可以抑制細菌的生長，還能激活放線菌孢子的萌發(fā)。為了更有效地抑制非目的微生物的生長，要加入一些專一性的抑制劑。 采取調(diào)節(jié)pH的方法來抑制非目的微生物的生長，雖然能起到一定的作用，但并不是對所有的菌類都有效。如果培養(yǎng)液中的酸堿變化很大，磷酸鹽的緩沖容量不足以調(diào)節(jié)pH變化，則可適當加入碳酸鈣，以不斷中和菌體代謝過程中產(chǎn)生的酸類，使培養(yǎng)基的pH能保持在恒定的范圍內(nèi)。如發(fā)酵過程缺氧，則代謝向有機酸合成方向進行，pH下降。無機鹽的性質也會影響pH變化，（NH4）2SO4是生理酸性無機氮源，其中NH4+被菌體利用，留下SO42—，培養(yǎng)液變成酸性。因為微生物在生長繁殖過程中，由于代謝作用會產(chǎn)生酸性或堿性產(chǎn)物，pH發(fā)生變化，微生物生長受到抑制。大多數(shù)水解酶的生長最適pH基本相近，而酶的作用pH未必與產(chǎn)酶pH相同。其分離方法是：取紅芋粉醪20%、檸檬酸10%～20%配成培養(yǎng)液，～，以一定量的培養(yǎng)基和土樣均勻混合，用毛細吸管點種在平皿內(nèi)事先覆蓋的無菌濾紙上（2～3層），于30℃培養(yǎng)，這樣可以分離到產(chǎn)生檸檬酸的黑曲霉。這不僅有利于自身生長，也可排除一部分不需要的菌類。 細菌、放線菌的生長繁殖對pH一般要求偏堿，霉菌和酵母菌要求偏酸。純種分離時，把以上瓊脂平板置于適宜的溫度培養(yǎng)一定的時間，如具有產(chǎn)生水解酶能力的菌株，便在菌落四周形成水解圈或呈色圈，根據(jù)圈的大小可初步判斷酶活力強弱。但不同菌種對營養(yǎng)要求差別很大，如奴卡氏菌在有氧條件下用普通培養(yǎng)基即可分離到，而以色列放線菌則在有CO2存在且有適宜培養(yǎng)基的情況下才能正常生長繁殖。 放線菌是生產(chǎn)抗生素和酶制劑的重要來源。二、通過控制培養(yǎng)和培養(yǎng)條件進行分離 各種微生物對營養(yǎng)要求和培養(yǎng)條件是不同的，在分離篩選時若在這兩個方面加以調(diào)節(jié)控制，就能獲得更好的分離效果。目前人們已經(jīng)克隆到PHAs合成途徑的關鍵酶基因，包括：phbA(β酮硫裂解酶基因)、phbB(依賴NADPH的乙酰CoA還原基因)、phbC（PHB合成酶基因）。用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的聚β羥基脂肪酸（polyhydroxyalkanoic acid,PHAs）也成為研究生物降解塑料的熱點，其中利用真氧產(chǎn)堿桿菌（Alcaligtnes eutrophus）合成PHB的研究最多。有些生物降解塑料是以簡單的物理共混工藝，將淀粉填充到聚乙烯等樹脂內(nèi)，淀粉可以被微生物分解，但樹脂分子骨架在很長時間內(nèi)仍分解不了，反而為廢棄塑料的回收增加了困難。 除尋找能夠降解廢舊塑料的微生物外，根治白色污染的最好方法是用降解塑料替代現(xiàn)有塑料。除馴化培養(yǎng)進行降解菌的篩選外，還可采用階段式篩選法。這可能是因為絲狀體更容易深入共混物內(nèi)部生長。通常采用富集法進行篩選，如日本的小野勝道教授以低濃度聚乙烯作為富集培養(yǎng)基對土壤微生物進行馴化，分離到了三種能降解聚乙烯的細菌。如Harris在分離以氯化物為氮源的細菌時，把浸透了KCN溶液的濾紙放到平皿蓋上，濾紙所產(chǎn)生的HCN蒸氣逐漸滲入含無機鹽的分離培養(yǎng)基，每天用新制備的浸濕KCN的濾紙更換，培養(yǎng)一段時間后，從平皿上長出的菌落中進行分離，便容易得到分解氰化物的菌株。 在篩選環(huán)保降解菌時需注意，某些有毒污染物由于本身對微生物的生長有抑制作用，如果直接在培養(yǎng)基中加入該物質連續(xù)富集培養(yǎng)，可能效果不佳。 采用該方法分離苯胺、DDT、甲基對硫磷（MP）石油、甲胺磷等污染物都取得了良好的效果。經(jīng)過幾個月的連續(xù)培養(yǎng)后，將富集培養(yǎng)液劃線或涂布于分離平板上，便能篩選到所需的環(huán)保降解菌株。在分離篩選這類物質的降解微生物由于該物質為唯一碳源或氮源的培養(yǎng)基進行富集培養(yǎng)。該方法能夠得到單細胞或單孢子，較為精確，但操作時要細，否則不易得到理想結果。具體作法如下：取與皿內(nèi)徑大小一致的濾紙3～4層，浸在培養(yǎng)液中，取出放在空皿內(nèi)，在濾紙上滴幾滴甘油以防干燥，蓋好皿蓋，滅菌。顯微鏡下觀察每個小滴，將只有一個孢子的小滴位置作好記錄，恒溫培養(yǎng)，挑取單菌落于斜面。具體方法有多種，現(xiàn)主要介紹檸檬酸產(chǎn)生菌采用的小滴分離純化方法。將收集到的孢子用稀釋法在馬鈴薯—蔗糖培養(yǎng)基平板上進行單孢子分離，培養(yǎng)后把單孢子長出的菌落移接到斜面上，進行生產(chǎn)性能比較試驗。將這套孢子收集器移到恒溫室內(nèi)培養(yǎng)1～2天，將有大量孢子彈到平皿上，收集孢子（）。（2）單孢子分離法 取一條鐵絲，彎曲成蚊香支架形狀，放在已消毒的玻璃板上。懸掛的子實體距離培養(yǎng)基平板2～3cm。孢子采集裝置：用一條兩端彎成鉤的鐵絲，一端鉤著一塊成熟的蠶豆大子實體，另一端掛在三角瓶的瓶口上。對子實體無膜外露的平菇等，不適于用升汞溶液浸泡，要用75%的酒精進行表面消毒，再用無菌水沖洗。因此，從育種角度最好采用單孢子分離。 食用菌的孢子分離法通常有兩種，即多孢子分離和單孢子分離。由這種方法挑選的菌株往往不純，必須在瓊脂平板上再分離純化，然后挑取單個菌落于斜面，進一步篩選。長出微生物。以10％％升汞浸泡2～5分鐘進行表面消毒，無菌水沖洗。如從患惡苗病的水稻組織中分離赤霉素，從根瘤中分離根瘤菌及從各種食用菌的子實體中分離孢子等。采用抑菌圈法，不僅能篩選抗生素，而且還能篩選某些酶類。三國霉素和多氧菌素就是通過該方法篩選得到的。 在篩選抗霉菌抗生素時，需根據(jù)其特點進行篩選，因霉菌與哺乳動物細胞性質相似，為減少藥物對人體的副作用，需挑選對霉菌有抗性但對人體安全的抗生素。因此，從魚組織和蝦消化道里分離篩選抗癌藥物和抗炎癥藥物是一個有效地途徑。 海洋是新抗生素的重要來源。如在篩選抗細菌抗生素時，傳統(tǒng)上常用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌作為檢驗菌來檢驗抗生素的抗性。除上述的抑菌圈外，稀釋法、擴散法、生物自顯影法等也不同程度的得到應用。 由于現(xiàn)有抗生素種類多樣，得到新的抗生素越來越困難。分離于瓊脂平板上，控制孢子濃度，使長成獨立菌落，一直培養(yǎng)到青霉素產(chǎn)量達到頂峰，鋪張于菌落平板表面，凝固后，培養(yǎng)17～20h。采用該方法已經(jīng)得到很多有用的抗生素，如春雷霉素和青霉素等。 抑菌圈法是常用的初篩方法，工具菌采用抗生素的敏感菌。據(jù)估計，篩選1萬個菌株才能得到1株有用的生產(chǎn)菌。 常用于抗生素產(chǎn)生菌的 分離篩選。 如嘌呤營養(yǎng)缺陷型大腸桿菌（）與不含嘌呤的瓊脂混合倒平板，在其上涂布含菌樣品保溫培養(yǎng)，周圍出現(xiàn)生長圈的菌落即為嘌呤產(chǎn)生菌。工具菌是一些相對應的營養(yǎng)缺陷型菌株。因此生成乙醇的菌落便顯出一個淡白色的圈，暈圈的大小可初步表示乙醇的產(chǎn)量。 通過平板上